作 者：路桥,张先林,王洪巨,黄宇理,史晓俊,李妙男,张恒
作者单位：蚌埠医学院第一附属医院心血管内科
作者简介：路桥,硕士研究生在读,主要从事心血管疾病相关研究。
通信作者：王洪巨,E-mail:hongjuwang1@ sina. com
基金项目：
安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2019A0401);蚌埠医学院自然科学重点项目(2021byzd097)
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引用本文
路桥, 张先林, 王洪巨, 等. 葡萄糖调节蛋白 94 和转化生长因子-β1 与房颤患者预后的相关性[J]. 实用心电学杂志, 2023, 32(2):115 - 122.DOI:10. 13308 / j. issn. 2095 - 9354. 2023. 02. 008
LU Qiao, ZHANG Xianlin, WANG Hongju et al.
Relativity between glucose-regulated protein 94, transforming growth factor-β1 and prognosis of patients with atrial fibrillation[J].Journal of Practical Electrocardiology,2023, 32(2):115 - 122.DOI:10. 13308 / j. issn. 2095 - 9354. 2023. 02. 008
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摘要
目的 探讨葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94, GRP94）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）水平对房颤患者消融术后远期复发事件的预测价值。方法 选择因房颤行射频消融术的住院患者共202例,统一归于房颤组，再依据房颤发生及持续的时间进一步分为阵发性房颤组（n=132）和持续性房颤组（n=70）；另选择窦性心律且既往无房颤心律的健康体检者作为对照组（n=55）。通过酶联免疫吸附试验测定患者的血清GRP94及TGF-β1水平，并收集基线资料。出院后以门诊或电话形式对房颤患者进行随访，利用受试者工作特征曲线和Kaplan-Meier生存分析评估血清GRP94、TGF-β1水平对房颤患者消融术后远期复发事件的预测价值。结果 在对照组、阵发性房颤组、持续性房颤组中，血清GRP94及TGF-β1水平依次升高。二元Logistic回归分析提示，血清TGF-β1、GRP94和体重指数是房颤发生的独立危险因素。Spearman相关性分析显示，在房颤患者血清中GRP94和TGF-β1水平呈正相关。复发组的TGF-β1高于非复发组，GRP94低于非复发组。二元Logistic回归分析表明，TGF-β1是房颤术后复发的独立危险因素，GRP94是房颤复发的独立保护因素。Kaplan-Meier曲线分析显示，GRP94高水平、TGF-β1低水平的房颤患者消融术后复发的风险低，且未复发时间更长。结论 GRP94及TGF-β1水平与房颤密切相关，可能为房颤患者消融术后复发的早期识别、诊断及预防提供依据。
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关键词
房颤；心房纤维化；葡萄糖调节蛋白94；转化生长因子-β1
房颤是临床中常见的心律失常，患病率正迅速上升。心房纤维化和重构被认为是房颤重要的病理生理机制，而心肌纤维化是导致房颤患者心脏重构的主要因素之一；在重度心房重构的患者中，轻度炎症可能足以引发房颤。随着对房颤的认识逐渐加深，其手术治疗方式也不断更新，包括射频或冷冻球囊消融、脉冲场消融等，然而，术后房颤复发问题依旧困扰着临床工作者。
蛋白质稳态的异常会导致心房重构及房颤的发展，而葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94, GRP94）参与蛋白质稳态的调节，也可通过内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）保护心肌细胞免于凋亡。GRP94与肿瘤密切相关，可促进肺癌、乳腺癌等癌细胞的转移。近年来，对GRP94的研究扩展到心脑血管领域。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）在胚胎发育、组织修复以及组织稳态维持中发挥重要作用。TGF-β1的过表达参与了糖尿病、肿瘤、肾脏以及心血管疾病的发生发展，特别是涉及肝脏、肾脏和心脏的纤维化过程。TGF-β1能促进房颤的发生发展，但房颤患者中GRP94与TGF-β1的相关性及其与房颤发生发展和房颤术后复发的相关性尚未阐明。
本研究通过观察血清GRP94和TGF-1在房颤患者中的表达水平，探究二者与房颤的相关性，为房颤患者的早期诊疗和复发预防提供新的理论基础。
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资料与方法
1.1 研究对象
连续入选2019年1月至2020年12月在蚌埠医学院第一附属医院明确诊断为房颤，住院并行房颤射频消融术、符合纳排标准的患者202例，统一归于房颤组（n=202）。依据患者既往病史、临床症状以及检查结果，将他们分为阵发性房颤组（n=132）和持续性房颤组（n=70）；另选择在本院接受健康体检为窦性心律且既往无房颤心律者作为对照组（n=55）。所有入选者平均（62.01±11.77）岁，其中男150例，女107例。本研究事先已取得所有研究对象的知情同意，并得到本院伦理委员会的批准。
排除标准：① 先天性心脏病、急性心肌梗死、冠心病、心脏瓣膜病等相关心血管疾病；② NYHA心功能分级Ⅳ级；③ 合并肝肾功能不全、恶性肿瘤、严重感染；④ 未得到很好控制的甲状腺疾病；⑤ 伴有免疫性疾病、血液系统疾病等慢性疾病。
1.2 血清样本采集及处理方法
所有入组患者皆在入院后于空腹状态下，用含肝素真空采血管（紫帽）抽取外周静脉血，使用离心机离心并分离血清，放在-80℃冰箱内冷冻备用。
采集血清后，运用酶联免疫吸附试验法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA），应用GRP94及TGF-β1试剂盒（南京飒迪生物技术有限公司），依据其说明对试剂盒进行处理。应用全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific, Finland）的吸光值读数（OB值）测定各孔的血清浓度并利用程序绘制标准曲线。计算并记录GRP94及TGF-β1的血清水平。
1.3 临床资料采集
采集年龄、性别、吸烟史、饮酒史等临床资料，并检测各项生化指标，包括高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、超敏C-反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）及D-二聚体（D-dimer, DD）等。
采用Samsung RS80A型超声仪，检测所有房颤患者的左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心房内径（left atrial diameter，LAD）、左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter, LVEDD）。
1.4 房颤射频消融方法
所有入组房颤患者皆行环肺静脉隔离消融。依据患者情况，部分患者于术中采用电复律转复窦性心律。
1.5 随访
出院后采用门诊和电话随访等方式，对202例房颤患者进行平均18个月的随访。主要随访内容：① 观察患者是否出现房颤复发（即消融3个月后出现持续时间≥30 s的房颤、心房扑动、房性心动过速）；② 对患者进行健康宣教，包括药物应用剂量及合理运动、饮食调整等生活方式的指导。这些患者中共9例失访，依据是否房颤复发，将193例随访患者分为复发组（n=58）及非复发组（n=135）。观察两组的基线资料并分别比较GRP94、TGF-β1水平的差异，依据所有房颤患者GRP94、TGF-β1的截断值进行分组。
1.6 数据分析方法
应用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行统计学处理。计量资料如符合正态分布，则用x±s表示，组间比较采用方差分析；否则以中位数（第一四分位数，第三四分位数）描述，采用非参数检验。分类资料采用构成比描述，组间比较采用χ2检验。房颤发生和复发的危险因素采用二元Logistic回归评估，相关性分析采用Spearman相关性分析。预测房颤术后复发的截断值采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线），应用Kaplan-Meier生存分析比较两组患者房颤术后复发的情况。以P＜0.05为差异有统计学意义。
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结果
2.1 基线资料比较
本研究共257例研究对象入组，其中男150例（58.37%）、女107例（41.63%），平均(62.01±11.77)岁。房颤组的体重指数（body mass index, BMI）显著高于对照组（P＜0.05）。两组ALT、AST、HDL、LDL、hs-CRP比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。房颤组患者的中性粒细胞/淋巴细胞较对照组更低，而房颤组的LAD明显高于对照组，LVEF低于对照组，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。
2.2 血清GRP94、TGF-β1水平比较
在对照组及房颤组中，血清GRP94的表达水平分别为43.54（35.21，62.99）、70.52（56.32，101.69）ng/mL；TGF-β1分别为73.61（63.59，81.79）、103.41（92.56，113.54）ng/mL。房颤组GRP94及TGF-β1水平均显著高于对照组（Z=－8.864，－6.469；P＜0.05）。见图1。
2.3 房颤发生的危险因素
将基线资料中差异有统计学意义的BMI、LAD、LVEF、GRP94、TGF-β1及中性粒细胞/淋巴细胞纳入二元Logistic回归分析，得出血清TGF-β1、GRP94和BMI是房颤发生的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。
2.4 房颤患者血清GRP94、TGF-β1水平的相关性
利用Spearman相关性分析，探讨房颤组患者血清中GRP94和TGF-β1相对表达量之间的相关性，结果提示两者呈正相关（r= 0.287，P＜0.05）。见图2。
2.5 亚组分析
对照组、阵发性房颤组及持续性房颤组的GRP94水平依次升高，分别为43.54（35.21，62.99）、71.39（58.22，78.67）和76.82（71.49，83.55）ng/mL；TGF-β1水平亦依次升高，分别为70.52（56.32，101.69）、101.30（85.67，110.14）和108.54（100.98，119.99）ng/mL，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。
2.6 复发组与非复发组基线资料比较
对202例房颤患者进行随访，失访9例（4.46%），复发房颤的有58例（30.05%），未复发房颤的有135例（69.95%）。复发组的LAD、LVEDD明显高于非复发组，LVEF小于非复发组，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
2.7 复发组与非复发组GRP94、TGF-β1水平比较
GRP94在复发组及非复发组的表达水平分别为65.64（56.03，78.24）、75.01（67.32，81.57）ng/mL，TGF-β1则分别为108.54（101.36，122.25）、101.24（85.64，109.64）ng/mL。复发组GRP94水平低于非复发组，TGF-β1水平高于非复发组，且差异均有统计学意义（Z=－3.513，3.976；P＜0.05）。见图5。
2.8 房颤复发的危险因素
将基线资料中差异有统计学意义的LAD、LVEDD、LVEF、GRP94及TGF-β1纳入二元Logistic回归分析，结果显示，TGF-β1、LAD是房颤复发的独立危险因素，而GRP94、LVEF是房颤复发的独立保护因素（P＜0.05）。见表4。
2.9 GRP94、TGF-β1预测房颤复发的ROC曲线
通过ROC曲线评估血清GRP94水平对房颤术后复发事件的预测价值。结果提示，GRP94预测房颤患者术后复发的曲线下面积（area under curve, AUC）为0.641（0.550，0.731），最佳截断值71.55 ng/mL，特异性66.7%，敏感性63.8%；TGF-β1预测房颤患者术后复发的AUC值0.681（0.601，0.760），最佳截断值101.30 ng/mL，特异性51.1%，敏感性77.6%（P＜0.05）。见图6。
2.10 GRP94、TGF-β1与房颤复发的Kaplan-Meier生存分析
根据ROC曲线分析结果，预测房颤术后复发事件的GRP94、TGF-β1截断值分别为71.55、101.30 ng/mL，据此将房颤患者分为GRP94＞71.55 ng/mL组和GRP94≤71.55 ng/mL组，或是TGF-β1＞101.30 ng/mL组和TGF-β1≤101.30 ng/mL组。Kaplan-Meier曲线分析显示，GRP94＞71.55 ng/mL组和TGF-β1≤101.30 ng/mL组消融术后复发风险更低，未复发时间更长（χ2=13.370，13.013；log rank P＜0.01）。见图7。
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讨论
在许多国家，随着年龄的增长，房颤的发病率呈上升趋势。2017年，全球房颤患者约3 757万人，高于2007年的2 853万及1997年的2 216万；2017年全球房颤死亡人数为28.7万，较2007、1997年分别增长了48%和105%：近20年间，房颤的发病及死亡率几乎呈线性增长，给患者带来了巨大的健康及经济负担。探究与房颤发生发展及预后相关的标志物，对患者的早期诊断和临床治疗有重要意义。
GRP94作为重要的分子伴侣之一，是 ERS的典型标志。在外界不利因素的刺激下，未折叠蛋白增多或错误折叠蛋白蓄积，会影响蛋白质稳态，此时ERS被激活，并导致未折叠蛋白应答，造成GRP94水平升高，以恢复内质网及蛋白质稳态，避免细胞凋亡。心肌细胞中钙离子处理的失调在很大程度上促进了心律失常的发生和进展，而GRP94作为钙离子结合蛋白参与了内质网及细胞内钙稳态的维持，因此心脏中分泌的GRP94有助于增强心肌细胞活力，从而保护心脏。
TGF-β1作为TGF-β家族中的一员，在调节炎症，细胞的增殖、分化和组织愈合中起着重要作用。TGF-β1是心房间质胶原合成和代谢过程中重要的细胞因子，在与膜连接受体激酶结合后，其信息主要通过Samd蛋白信号通路传导，刺激胶原蛋白的生成，促进内皮细胞间质转化。TIAN等和WU等研究发现，无论是在阵发性还是持续性房颤患者中，TGF-β1均是消融术后复发的危险因素。在调节性T细胞（Tregs）分泌的活性TGF-β参与炎症及免疫调节的过程中，也有GRP94的参与，且当GRP94水平降低时，活性TGF-β的分泌也随之减少。
本研究发现，GRP94、TGF-β1在对照组、阵发性房颤组、持续性房颤组中的水平依次升高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。二元Logistic回归分析显示，血清TGF-β1、GRP94和BMI是房颤发生的独立危险因素。VITADELLO等在患有慢性房颤的山羊和人类细胞中均观察到GRP94水平升高，这与本研究结论相符。Spearman相关性分析显示，在房颤患者血清中GRP94和TGF-β1水平呈正相关。
GRP94是细胞表面蛋白糖蛋白A重复显性(GARP)的必需伴侣。在有GRP94缺陷的Tregs上，GARP和整合素的缺失会导致活性TGF-β的低效生产。
本研究对房颤患者进行了平均18个月的门诊或电话随访，有58例(30.05%)患者术后再发房颤。依据随访中是否复发房颤，把房颤患者分为复发组及非复发组，发现复发组的LAD、LVEDD、TGF-β1显著高于非复发组，LVEF及GRP94低于非复发组，提示较高的LAD、LVEDD、TGF-β1，较低的LVEF及GRP94可能是复发组的重要特征。二元Logistic回归分析显示，TGF-β1、LAD是房颤发生的独立危险因素，GRP94、LVEF是房颤发生的独立保护因素。
ROC曲线分析显示，GRP94、TGF-β1预测房颤消融术后复发事件的截断值为71.55、101.30 ng/mL。根据截断值将房颤患者分组，并进行Kaplan-Meier曲线分析显示，血清GRP94高水平、TGF-β1低水平的房颤患者消融术后复发的风险低，未复发时间更长。根据本研究结果，临床上可有针对性地通过房颤患者术前GRP94、TGF-β1水平有效识别房颤消融术后复发风险高的患者，进而监测该部分患者术后状态并进行针对性治疗，有效控制房颤消融术后复发率，延长患者生存时间，提高其生存质量。
既往对GRP94的研究多为基础研究，与肿瘤相联系，目前尚未见到GRP94与房颤射频消融术后远期预后的相关报道。GRP94在房颤中的作用机制并未明确。ERS是一种保护性反应，但具有双面性：适度的ERS可以促进蛋白质稳态恢复，维持细胞的功能及结构，而过度的ERS可能会引起细胞凋亡。本研究中主要通过电话随访，不能排除患者主观因素造成的病情描述不真实，随访结果准确性稍差,且未动态追踪GRP94水平的变化。因此，本研究得出的结论是否普遍适用，或是否存在其他相关机制导致结果偏差尚不确定，仍需大样本、多中心研究进一步证实。
综上所述，GRP94及TGF-β1水平在房颤患者体内明显升高，TGF-β1是房颤发生的独立危险因素，GRP94是其独立保护因素。血清GRP94高水平、TGF-β1低水平的房颤患者消融术后复发的风险较低，可能为房颤术后复发的早期识别、诊断及预防提供依据，从而有助于改善患者的生活质量及远期预后。但本研究也存在一些局限性，如本研究属于单中心、随机研究；样本量不多，持续性房颤组例数较少，未进行细致分组；房颤患者术后随访时间不长，因此上述结论仍需进一步研究加以证实。
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