导语
今天给同学们分享一篇关于甲基化+预后模型的生信文章 “ Analysis of m6A RNA Methylation-Related Genes in Liver Hepatocellular Carcinoma and Their Correlation with Survival ”，这篇文章于2021年3月发表在 Int J Mol Sci 杂志上，影响因子=4.183。在研究中，作者旨在分析来自TCGA的数据，以确定LIHC中重要的m6A RNA甲基化相关基因，并评估m6A RNA甲基化相关基因在肝癌中的相互作用、功能和预后价值。同时，还试图建立一个预后模型来预测LIHC患者的生存状态。
1.鉴定与AJCC阶段相关的m6A相关基因
与LIHC相关的1190个m6A RNA甲基化相关基因都是用AJCC阶段和RNA-seq表达数据选择的。根据AJCC分期聚类的亚组共获得405个m6A RNA甲基化相关基因。这些m6A RNA甲基化相关基因在肝癌的不同临床阶段表达不同。候选m6A RNA甲基化相关基因在不同AJCC阶段的不同表达情况如图1所示。显然，有9个m6A RNA甲基化调控因子在亚组之间存在显着差异：METTL3, Methyltransferase-like 16 (METTL16), WTAP, RBM15, YTH domain containing 1 (YTHDC1), YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1 (YTHDF1), YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 2 (YTHDF2), Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (HNRNPC)和FTO，包括“writer”,“reader”,“eraser”。
图1 m6A RNA甲基化相关基因在肝癌不同阶段的表达
2.生存相关m6A RNA甲基化相关基因的功能注释
采用单因素分析方法分析m6A RNA甲基化相关基因与TCGA肝癌患者生存时间的关系。从候选m6A RNA甲基化相关基因中获得254个生存相关基因，与生存时间显着相关（p < 0.05），包括m6A RNA甲基化调控因子METTL3、WTAP、RBM15、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC。通过STRING构建生存相关基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络，识别PPI网络中的Hub基因，如图2a所示。Hub基因占据了PPI网络中的关键节点，在PPI网络中发挥了重要作用。DNA topoisomerase 2-alpha (TOP2A), exodeoxyribonuclease 1 (EXO1), serine/threonine-protein kinase Nek2 (NEK2), baculoviral IAP repeat-containing protein 5 (BIRC5), hyaluronan mediated motility receptor (HMMR), structural maintenance of chromosomes protein 4 (SMC4), bloom syndrome protein (BLM), casein kinase I isoform epsilon (CSNK1E), cytoskeleton-associated protein 5 (CKAP5), inner centromere protein (INCENP) 被确定为基于节点的程度的Hub基因超过10个（图 2a）。TOP2A、EXO1、NEK2、BIRC5、SMC4、BLM、CSNK1E、CKAP5和INCENP与DNA复制和细胞分裂有关，HMMR与细胞运动有关。富集分析由ClueGO进行，包括Gene Ontology (GO) 和Pathway，如图 2b、c 所示。结果表明，SUMOylation of DNA replication proteins, HDR through Homologous Recombination (HRR), the Fanconi Anemia Pathway, SUMOylation,和SUMO E3 ligases SUMOylate target proteins的富集程度最高。
图2 蛋白质-蛋白质相互作用网络和富集分析
3.m6A RNA甲基化相关基因构建的风险特征
采用relief算法筛选重要的生存相关基因（图3a）。来自TCGA的LIHC队列中的 9 个m6A RNA甲基化相关基因被选择用于进一步生信分析。它们是uridine-cytidine kinase 2 (UCK2)、filensin (BFSP1)、tubulin-specific chaperone D(TBCD)、histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 (PRDM16)、phosphorylase b kinase regulatory subunit alpha (PHKA2)、serine/threonine-protein kinase BRSK2 (BRSK2)、Arf-GAP with coiled-coil (ACAP3)、general transcription factor 3C polypeptide 2 (GTF3C2) 和guanine nucleotide exchange factor MSS4 (RABIF)（图 3b）。LIHC队列根据风险评分的中值分为高风险组和低风险组。进行Kaplan-Meier生存分析以分析两组之间的差异。结果显示，低风险患者的总生存期明显优于高风险患者（图 3c-e）。
图3 m6A RNA甲基化相关基因的风险评分
为了探索预后模型与各种临床特征之间的相关性，对临床特征与风险评分进行了生信分析。性别、AJCC分期、分级、T和N在高风险和低风险的亚组之间存在显着差异。高风险组和低风险组之间的年龄和M没有显着差异。重要生存相关基因的表达及相应患者的各种临床特征如图4所示。基于重要生存相关基因，通过不同的机器学习算法建立预后模型，如图5所示。基于RandomForest构建的预后模型具有较好的预测性能（AUC = 0.70），表明该预后模型可用于预测LIHC患者的生存，并可作为评估患者预后的指标。
图4 m6A RNA甲基化相关基因在不同风险组中的热图
图5 ROC曲线显示了预后模型的预测效率
为了更好地分析九个重要的生存相关基因之间的相互作用和功能，对这些基因之间的相互作用和相关性进行了生信分析。基于HuRI构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，在网络中获得了7个重要的生存相关基因（图6a）。根据GO富集分析（图 6b）和通路分析（图 6c），这些基因与virion assembly, vesicle docking, exocytic process, vesicle docking involved in exocytosis, Rab protein signal transduction,cellular carbohydrate catabolic process通路有关。生存相关基因的相关性通过Spearman相关性显着计算，如图6d所示。显然，GTF3C2、BFSP1和RABIF与UCK2呈正相关，而BFSP1与GTF3C2呈正相关。
图 6 m6A RNA甲基化相关基因的相互作用、功能和相关性
4.重要m6A相关基因对不同临床结果的预后价值
为了具体分析9个重要m6A相关基因在肝细胞癌中的预后价值，使用R包ConsensusClusterPlus将9个生存相关m6A RNA甲基化相关基因的表达分为不同的亚组。根据TCGA从2到12的聚类稳定性来展示重要m6A相关基因的表达相似性，K=2应该是一个适当的选择（图 7a-d）。当基于Kolmogorov-Smirnov检验、分期、分级和T进行生信分析时，簇1和簇2的临床特征显着不同（图 7e）。此外，两个簇之间的生存时间存在明显差异（图 8a）。九个选定的生存相关m6A RNA甲基化相关基因的表达显着不同。这些基因与较差的存活率相关，如图8b-j所示。
图7 通过使用m6A RNA甲基化相关基因分为2个亚型
图8 m6A RNA甲基化相关基因对集群进行Kaplan-Meie生信分析
小结
总之，作者的研究阐明了m6A RNA甲基化相关基因在肝癌中的表达、相互作用、功能和预后，构建了预后模型，还发现了m6A RNA甲基化相关基因与临床特征之间的关系。许多基因被认为是潜在的药物靶点，为肝癌的治疗提供了新的治疗策略。作者的研究为进一步研究RNA m6A甲基化及相关基因在肝癌中的作用提供了重要证据。
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