导语
1. 与健康样本相比，非肿瘤DCM中PRG的表达变化
PRG 的表达相互作用显示在蛋白质-蛋白质网络（图 1a）中，使用STRING数据库确定，具有111个边和33个节点。作者观察到置信水平为 0.700，除了PLCG1、GPX4、PRKACA、ELANE和DFNB89之外，其余的PRG之间的联系非常紧密。此外，研究了转录组关系，作者发现 GSDMD 和 GPX4 是所有样本和DCM样本中最相关的PRG调节因子，这可能表明它们一起工作（图 1b）。同时，差异表达分析确定了19个表达改变的PRG（图 1c和1d）。其中TNF的倍数变化最大且最显着（图1e）。
图1 DCM中PRG的表达情况
2. PRG参与非肿瘤DCM生成过程
为了确定PRG在非肿瘤DCM发病机制中的作用，作者使用了几种常见的生信分析。为了识别非肿瘤DCM相关的PRG，作者使用了单变量逻辑回归，这表明21个PRG与非肿瘤DCM最密切相关（图 2a）。随后，对21个DCM相关的PRG进行LASSO回归以进行特征选择（图 2b 和 2c），最终确定了12个中心PRG。作者使用多元回归来区分正常样本和非肿瘤DCM样本（图 2d）。分类器由集线器PRG组成，可以很好地根据风险评分对正常样本和非肿瘤DCM样本进行分类。DCM的风险评分远高于正常样本（图 2e）。此外，ROC曲线显示12个PRG可以区分正常和DCM样本（AUC = 0.99，图 2f）。这些结果表明PRG在非肿瘤DCM的发展中起着至关重要的作用。
图2 PRG 可用于对正常和DCM样本进行分类
3. PRG与DCM组织中的免疫特性有关
为了研究PRGs和免疫微环境之间的生物学行为，作者分析了12个中枢PRGs、浸润免疫细胞和免疫相关信号通路的表达。统计分析揭示了健康样本和 DCM 样本之间浸润性免疫细胞丰度的差异。与健康的心肌组织相比，大多数浸润性免疫细胞在DCM中发生了改变。相关分析显示，12个中心PRG与大多数免疫细胞密切相关（图 3a）。例如，GSDMD与pDC丰度的正相关性最强（r = 0.75），与Treg丰度的负相关性最强（r = -0.65），这与GSDMD、pDCs和Tregs的表达状态有关。此外，作者发现CASP1与副炎症呈正相关（r = 0.73），而CASP9与II型IFN反应呈负相关（r = -0.42）（图 3b）。这表明CASP1和CASP9在DCM的副炎症或II型IFN反应中起重要作用。
图3 PRGs与免疫细胞和免疫反应途径的关联
4. DCM中PRG介导的细胞焦亡模式
基于29个PRG的表达，作者对DCM样本进行了无监督的共识聚类分析，以研究DCM中的细胞焦亡模式（图 4a-4c）。确定了两种不同的DCM亚型。PCA显示PRGs的表达在亚型之间存在质的差异，包括亚型A中的70个样本和亚型 B 中的 96 个样本（图 4d）。此外，相关分析表明不同模式之间的临床特征没有显着差异（图4e）。除 CASP6、CASP9、GSDMA、GSDMB、GSDME、IL18、NLRP1、NLRP2、PJVK、PRKACA 和 TNF 外，其余 19 个 PRG 在不同焦亡模式中的表达存在明显差异（图 4f和4g）。在 DCM 中验证了多种细胞焦亡模式。
图4 在DCM中识别两种不同的细胞焦亡模式亚型
5. 不同细胞焦亡模式的免疫微环境特征
为了确定这些不同细胞焦亡模式之间免疫微环境特征的差异，作者评估了免疫细胞、免疫反应基因组和人类白细胞抗原(HLA)基因表达。两种模式之间的许多免疫细胞不同（图 5a）。与模式B相比，模式A的浸润免疫细胞相对较少。模式B显示出更高水平的aDC、DC、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞、T辅助细胞、Tfhs 和 TIL。值得注意的是，只有Treg细胞在A模式中更富集。此外，在免疫反应方面，B模式的免疫反应更活跃。例如，MHC I类和HLA的免疫反应在模式B中非常活跃（图 5b）。同时，作者观察到HLA基因表达的相似趋势（图 5c）。这些结果表明，细胞焦亡模式B介导更活跃的免疫反应，而细胞焦亡模式A介导的免疫反应相对温和。这些结果再次有力地证明了细胞焦亡对DCM不同免疫微环境的形成具有重要的调控作用。
图5 不同细胞焦亡模式下免疫微环境特征的差异
6. 焦亡模式的生物学特征
为了研究焦亡模式的生物学反应，进行了GO生信分析和KEGG生信分析。作者应用GSVA富集生信分析来估计所评估的生物途径的活性。在KEGG通路生信分析中，与模式A相比，模式B具有更丰富的通路，如NOTCH信号通路和磷酸戊糖通路（图 6a）。在 GO 通路生信分析中，与模式 A 相比，模式 B 还具有更丰富的通路，例如抗菌体液反应和其他生物过程（图 6b）。为了研究与 PRG 介导的调控相关的基因机制，作者鉴定了与细胞焦亡表型相关的 DEG。共有2142个常见基因被认为与细胞焦亡表型相关（图7a），GO富集生信分析表明它们主要参与免疫反应中中性粒细胞活化等免疫过程（图7b）。此外，在KEGG生信分析中，选择的DEG富集生物学过程与细胞因子-细胞因子受体相互作用等生物学过程显着相关（图 7c）。此外，作者使用WGCNA来识别与不同修饰相关的基因-基因模块（图 7d-7f）。作者确定了三个基因模块，其中不同的细胞焦亡模式与其相关基因相匹配（图 7g）；例如，焦亡模式A与洋红色模块中的基因密切相关（图 7h）。上述结果可以阐明细胞焦亡模式介导了相关的基因表达调控网络。
图6 两种细胞焦亡模式之间潜在生物学功能特征的多样性
图7 DCM细胞焦亡表型相关基因的鉴定和生信分析
7. 验证DCM中五个核心PRG的表达水平
根据生信分析结果，作者进一步验证了五个核心 PRGs（NLRP1、TNFα、CASP1、CASP9 和 PRKACA）在健康小鼠心肌组织和Dox诱导的DCM心肌组织中的表达（图 8a和8b）。RT-PCR结果显示，DCM心肌组织中NLRP1、TNFα、CASP1、CASP9和PRKACA的mRNA表达明显高于正常心肌组织，与生信分析结果一致（图8c）。
图8 验证基因的表达水平。
小结
总之，细胞焦亡在扩张型心肌病的免疫调节中起关键作用。研究表明，细胞焦亡通过影响浸润性免疫细胞，对不同免疫微环境的形成具有重要的调节作用。该研究为了解扩张型心肌病的发病机制提供了新思路，在未来具有非常重要的意义。
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