导语
今天给同学们分享一篇关于单细胞景观揭示胃癌肿瘤微环境中的活性细胞亚型及其相互作用的生信文章“ Single-cell landscape reveals active cell subtypes and their interaction in the tumor microenvironment of gastric cancer ”，这篇文章于2022年5月发表在 Theranostics 杂志上，影响因子=11.556。在这项研究中，该单细胞图谱提供了从分子水平了解胃癌细胞异质性的信息，并将成为开发创新的早期和伴随诊断以及发现胃癌新靶向治疗的宝贵资源。
1. 单细胞RNA-seq确定胃癌的七种主要细胞类型
作者收集了9例未经治疗的非转移性胃癌患者的新鲜肿瘤样本和邻近非肿瘤样本，其中6名患者患有近端胃癌（标记为P01-P06），3名患者患有远端胃癌（标记为D01-D03）。进行生信分析后共获得47304个细胞，可检测到200多个基因的表达，可以使用基于图的聚类获得17个细胞簇（图1B）。基于典型标记基因的表达和这些簇顶部不同表达的基因，研究将这些簇分为七种主要细胞类型，包括T细胞和NK细胞（6簇）、B细胞（2簇）、髓样细胞（2簇）、肥大细胞（1簇）、成纤维细胞（3簇）、内皮细胞（1簇）、上皮细胞和恶性细胞（3簇）。
图1 胃癌及邻近非恶性标本的单细胞RNA-seq
2. 胃癌中调节性T细胞的显著扩增
接下来，作者对T细胞和NK细胞进行重新分类，确定了14个不同的簇（图2A）。基于典型标记基因的表达和每个簇的差异表达基因（图2B），研究将这些簇注释为调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞和固有淋巴细胞（ILC）。对于CD4+细胞簇，T01被表征为具有CCR7特异性表达的天然CD4+T细胞。根据特异性表达的CXCL13，T04被归类为滤泡帮助T细胞，并且该簇增加了PDCD1和TIGIT的表达，表明处于耗尽状态。事实上，Treg信号基因在肿瘤样本中表现出一致的高表达（图2D）。与正常Treg相比，肿瘤Treg增加了与免疫抑制相关的多个基因的表达，包括DUSP4、IL2RA、TNFRSF4、LAYN和LGALS1（图2E）。肿瘤中Treg含量的增加，以及这些基因和通路的表达上调（图2F），这表明胃癌微环境的免疫抑制性质。
图2 胃癌中T细胞和NK细胞的分布
3. 在胃癌中未发现典型的耗尽性CD8+T细胞簇
作者分析了CD8+T细胞的两个主要簇（T05和T06）（图2A）。T05被鉴定为具有GZMK高表达和一组细胞毒性基因的效应记忆CD8+T细胞（TEM）。根据KLRC1和ITGA1/CD103的表达增加，T06被归类为组织驻留记忆T细胞（TRM）。有趣的是，在数据集中没有发现典型的耗尽型CD8+T细胞簇，这种细胞簇在各种肿瘤类型中经常被检测到（图2B）。
4.在胃癌中鉴定肿瘤特异性LAMP3+DC细胞
作者重新构建骨髓细胞簇并确定了15个簇（图3A），之后作者基于S100A8、S100A9和FCN1在这些簇中的高表达，M01-M03被鉴定为单核细胞（图3B-C）。M04-M07是基于低表达CD14和高表达HLA-DR基因的树突状细胞（图3B-C）。由于这些簇中CD68、CD163和MRC1的高表达，M08-M11因此被鉴定为巨噬细胞（图3B-C），其余三个未分类簇（M12、M13和M15）可能来自低质量细胞或双细胞。
另外，M04高表达CD1C、FCER1A和CLEC10A对应cDC2（图3C），M05高表达CLEC9A代表cDC1(图3C)，M07通过LILRA4的特异表达被鉴定为浆细胞样DC（pDC），但是作者注意到高表达LAMP3、CCL22和CCL19的M06与任何经典DC亚型均无联系（图3C）。与肿瘤和正常样本共享的前三种经典DC亚型不同，M06中几乎所有细胞都来自肿瘤样本，这表明了LAMP3+DC亚群在肿瘤样本中高度富集（图3D）。在TCGA数据集中的胃癌样本中，LAMP3+DC的特征基因的平均表达也高得多（图3E）。最后，为了探索胃癌中LAMP3+DC的起源，首先构建了髓系簇的树状图，发现LAMP3+DC与cDC1和cDC2聚集在一起（图3F），其次，对这三个亚群的轨迹生信分析表明，LAMP3+DC可能是由胃癌中的cDC2和cDC1发展而来的（图3G），单细胞调节网络推断和聚类生信分析表明，IRF1、IRF2、NFKB1和NFKB2的活性在LMAP3+DC中上调，这表明IRF家族和NF-kB是DC分化和成熟的关键调节因子。
图3 胃癌骨髓细胞的异质性
5. 胃癌中巨噬细胞的异质性
M09和M10是两簇C1QC+巨噬细胞，其特征是多个C1Q基因和抗原呈递基因的高表达（图3B）。M11具有多种干扰素诱导基因的高表达，例如ISG15、IFIT2和IFIT3（图3C）。在这四个巨噬细胞簇中，M08在肿瘤样本中显著富集（图3D），因此被指定为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。巨噬细胞通常分为促炎M1类和抗炎M2类，作者为了测试此处确定的巨噬细胞亚群是否符合经典M1/M2模型，评估了这些巨噬细胞亚型的M1和M2特征的表达，生信分析结果显示，INHBA+簇（M08）和ISG15+簇（M11）表现出更高的M1特征，而C1QC+簇（M9和M10）表现出更高的M2特征（图4A），这表明胃癌中巨噬细胞的体内极化不能用M1/M2模型来解释。在比较TAMs和C1QC+巨噬细胞的基因表达水平时，在INHBA+巨噬细胞中识别出49个上调基因，包括多种趋化因子，IL6，PTGS2，IL1RN和TIMP1（图4B）。在树状图中，INHBA+TAM和单核细胞位于单个分支中，这意味着该簇可能起源于肿瘤区域的浸润单核细胞（图4D），并且免疫浸润生信分析表明，在INHBA+TAM中，多种转录因子的活性特异性上调，包括RELB、NFKB1、NFKB2等。
图4 胃癌巨噬细胞的分子特征
6.成纤维细胞在新生血管和肿瘤发展中起着重要作用
成纤维细胞被认为是TME中具有高度可塑性的细胞群，但对于胃癌中成纤维细胞亚型和CAF（癌相关成纤维细胞）的定义尚未达成共识。研究在对3467个成纤维细胞重新分类后总共获得了11个成纤维细胞簇，并将其中三个指定为CAF（图5A）。研究表示，F01和F02均表达ACTA2，多个基因与肌肉收缩有关（包括ACTG2、MYH11和PLN）（图5B）。F01可以被注释为周细胞，表示该簇中RGS5和PDGFRB的高表达（图5B-C）。PDGFRB的免疫荧光染色显示周细胞位于血管周围（图5D），并证实周细胞在肿瘤样本中富集（图5E）。在该簇中观察到几种血管生成因子（包括ANGPT2、CAV1、NOTCH3、PDGFA、EPAS1和THY1）的表达增加。值得注意的是，PDGFRB高表达的胃癌患者在TCGA中预后不良。因此，该簇在胃癌的新生血管中起着至关重要的作用，并且生信分析结果表明，LRRFIP1、ETS1、EPAS2、MEF2C和SSRP1为上调的。
F03是正常样本中的主要成纤维细胞亚群（图5D），以CXCL14、POSTN、F3、PDGFRA和SOX6的高表达为标志。该簇的表达特征类似于人类结肠中间充质细胞的S2亚群，该亚群与结肠的上皮单层非常接近，并被认为在维持上皮内稳态中发挥了一些作用。研究观察到肿瘤组织中该亚群显著减少，这可能反映了肿瘤中上皮屏障的功能障碍。F06主要来源于正常样品，以CFD、CLU、COL14A1和PI16的高表达为标志。COL14A1+成纤维细胞已在多个人体组织的单细胞研究中得到鉴定，包括人肺和结肠组织，这表明了该簇可能代表多个组织中常见的成纤维细胞亚型。一组ECM分子（DCN、DPT、FBLN1、FBLN2、GSN和TNXB）在该簇中高度表达，并且发现多个补体因子在该簇中高度表达（图5C），这意味着该成纤维细胞亚群在先天免疫防御中发挥了一些作用。F04、F05和F08在肿瘤样本中显著富集，因此被表示为CAF的三个亚群。F04特异性表达CTHRC1（图5C），其在胃癌中过度表达，并与不良预后相关。CTHRC1的免疫荧光染色显示，在胃癌中，CTHRC1+细胞的位置是内皮细胞周围（图5E）。GSVA富集生信分析表明，该簇在ECM重塑相关通路中具有高活性，包括“弹性纤维形成”、“基质金属蛋白酶激活”和“胶原蛋白降解”。F05是COL14A1+成纤维细胞簇，其特征是C7和APOD的高表达（图5C）。F08特异性表达MMP1、MMP3和MMP9。转录因子TWIST1在F08中高度表达，已被证实为癌症相关成纤维细胞的关键调节因子。
图5 胃癌中成纤维细胞的分布
7. 肿瘤内皮细胞显示出高活性的血管生成
研究检测到1873个内皮细胞，其中大部分（88.2%）来自肿瘤样本，肿瘤内皮细胞的重新分类显示了九个不同的簇（图6A）。
图6 胃癌内皮细胞的细胞组成
E01是具有特异性表达尖端细胞标记物（包括ESM1、KDR和PDGFB）的尖端样细胞（图6B-C），在该簇中观察到。在TCGA中，胃癌样本中这些特征基因的表达更高，表明胃癌中的血管生成非常活跃（图6D）。上调基因的GO富集生信分析表明“血管生成”和“白细胞趋化性”在该簇中富集。E02和E03具有ACKR1和SELP的高表达（图6C），因此可以被指定为静脉内皮细胞，在TCGA数据集中，ACKR1基因高表达的胃癌患者预后不良（图6E）。E04高表达CD36和CA4（图6C），代表毛细血管内皮细胞。E05高表达动脉内皮细胞的多种标记物（GJA5、GJA4、SEMA3G和HEY1）。E07表达了许多干扰素诱导的基因（例如CXCL10、CXCL11、ISG15和IFIT3）。E09表示淋巴EC为LYVE1，CCL21在该簇中特异表达。
8. 内皮细胞和成纤维细胞在肿瘤血管生成中的相互作用增强
研究使用CellPhoneDB2，确定了肿瘤和正常样本中由各种配体和受体对介导的潜在细胞间相互作用，在正常样本中，三类髓样细胞中的细胞间相互作用略微富集（图7A）。内皮细胞和成纤维细胞之间的紧密相互作用表明，成纤维细胞与肿瘤血管生成和肿瘤血管系统的维持密切相关。除此之外，当检查不同内皮细胞亚群和成纤维细胞的细胞间相互作用时，研究发现EC-ESM1（尖端样内皮细胞）与四个成纤维细胞亚群（F01-F04）具有强烈的相互作用（图7B）。EC-ESM1与这四个成纤维细胞亚群的相互作用主要由PGF、VEGFA、PDGF基因及其受体介导（图7C），这些基因是血管生成的已知驱动因子。奇怪的是，FLT1和PGF的相互作用仅在EC-ESM1和Fib-RGS5中观察到，而在其他对内皮细胞和成纤维细胞簇中没有观察到。总之，内皮细胞和成纤维细胞相互作用的增强是胃癌细胞间相互作用的根本改变。
图7 胃癌中的细胞相互作用
9.前三项研究的重复性分析
三个已发表的scRNA序列数据集（PMID 32532891、34385296和34933901）用于验证数据集中确定的细胞亚群可以代表胃癌的细胞杂合度。PMID 32532891、PMID 34385296和PMID 34933901中确定的T细胞亚群的UMAP图，其中在所有三项生信分析研究中都发现了调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和自然杀伤细胞，显示了这些已发布的胃癌单细胞数据集中的髓样细胞聚类，在三个数据集中发现了15个聚类。此外，研究还分析了胃癌的成纤维细胞和内皮细胞，大多数亚型与研究结果相似。
小结
综上所述，作者的胃癌单细胞图谱可以更多地了解有效抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖和侵袭的潜在解决方案。对肿瘤结合单细胞测序揭示胃癌细胞异质性的生信思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询。
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