导语
1. 空间转录组学以识别结直肠癌中的肿瘤内异质性
在这项研究中，作者专注于来自先前发表的结直肠癌（CRC）研究的两名患者的空间转录组数据。首先，使用无监督聚类来聚类相似的ST点并分成九个不同的聚类（图1A、B）。其次，根据H&E切片和细胞标记对簇进行注释，然后识别出五个形态区域（图1A、C、D）。结果表明，无监督聚类生信分析可以有效地将具有相似特征的ST点聚集到同一簇中，例如成纤维细胞和肿瘤区域（图1E）。此外，无监督聚类生信分析还可以细分组织切片，这有助于发现肉眼不可见的组织异质性。
图1 空间转录组学(ST)用于识别结直肠癌的肿瘤内异质性
由于空间转录组的每个点都包含一个以上的细胞，因此其准确性低于单细胞测序。因此，作者通过ssGSEA算法对12种细胞类型的明确定义的基因集进行评分，以识别每个簇中包含的细胞类型。注释结果证明了使用ssGSEA在识别每个簇的细胞群方面的有效性。如图1F所示，成纤维细胞、肠细胞和平滑肌被精确注释，固有层由松散的结缔组织组成，含有多种细胞，如：树突状细胞、NK细胞等，而肿瘤区域明显富含单核细胞、NK细胞和上皮细胞，表明肿瘤区域存在免疫炎症微环境，与以往研究一致。总之，空间转录组分析结合ssGSEA可以准确确定细胞群中包含的细胞类型，并弥补ST中分辨率的不足。
2. 在CRC中确定了富含CAF的亚组
为了分析肿瘤区域的异质性，作者使用主成分分析（PCA）将肿瘤区域聚类为5个子簇（Tumor-subcluster0 ~ 4）（图2A）。为了找到每个簇的细胞类型和功能，作者分析了簇特异性差异表达基因（DEG），发现子簇0高表达的成纤维细胞标志物，例如：COL1A2、COL1A1、SPARC和COL3A1等（图2B），因此，作者将子集群0视为富含CAF的集群。之前在CRC的单细胞测序中发现了两种类型的CAF，其中CAF-A表达与ECM重塑相关的基因，而CAF-B表达肌成纤维细胞的细胞标志物，如ACTA2和TAGLN。从人类胰腺癌中鉴定出两种不同类型的CAF，称为mCAF和iCAF，一项新兴研究也证实了膀胱癌中存在两种不同的成纤维细胞亚型。如图2C所示，为了确认具有特定特征的CAF的存在，作者应用免疫荧光生信分析并检测了PDGFRA（iCAFs标志物）和RGS5（mCAFs标志物）在结直肠癌中的表达。此后，作者利用ssGSEA进一步研究了subcluster0的细胞亚型。结果显示subcluster0富含mCAFs（mCAFs-enrichedcluster）（图2D，F）。
图2 在CRC中确定了富含CAF的亚组
为了确定富含mCAF的簇的功能，作者进行了KEGG通路富集生信分析。如图2E所示，mCAFs富集簇（Tumor-subcluster0）与癌症等人中的ECM-受体相互作用、粘着斑和蛋白多糖有关，表明mCAFs在TME中具有ECM重塑的功能，即与之前的研究一致，这再次证明了ssGSEA对于空间转录组学数据是稳健的。此外，作者还对成纤维细胞区域进行了深入生信分析。结果显示，Fibro-subcluster1富含iCAFs，命名为iCAFs-enrichedcluster，Fibro-subcluster2富含mCAFs（图2G），因为它高度表达EPCAM，因此作者将其鉴定为富含mCAFs的肿瘤簇（图3D,E)。有趣的是，当用细胞标记注释子簇时，作者发现CAFs的标记，例如mCAFs中的RGS5和ACTA2，iCAFs中的PDGFRA和CXCL12，在某个子簇中没有特异性表达（图2F）。因此，这进一步表明10倍空间转录组数据的准确性是有限的，空间转录组学结合多维生信分析（如ssGSEA）可以提供更详细的信息。详细地，作者发现抗肿瘤免疫细胞如T细胞和树突状细胞在富含mCAFs的肿瘤簇中显着富集，iCAFs和巨噬细胞在富含iCAFs的簇中共同富集，但是抗肿瘤免疫细胞，尤其是NK细胞在富含iCAF的簇中显着减少（图2G）。据报道，CAFs可通过释放细胞因子、趋化因子等化合物抑制免疫系统，从而导致肿瘤转移，表明iCAFs在免疫微环境中的重要作用及其作为抗癌药物的价值目标。
3. iCAFs通过改变肿瘤微环境促进肿瘤发生
作者对成纤维细胞区域应用ssGSEA富集生信分析来揭示iCAF在TME中的功能，作者的结果表明iCAF与上皮间质转化（EMT）、胆固醇稳态、胆汁酸代谢和脂肪酸代谢相关（图3A）。为了进一步探索不同簇中EMT表型的过渡关系（图3B，C），作者通过拟时分析检查了不同簇中EMT标记的表达水平（图3F）。引人注目的是，结果表明EMT特征在iCAFs富集簇中的表达增加，而在肿瘤部位（Fibro-subcluster2）中缺乏表达。这些结果表明，CAFs，而不是肿瘤上皮细胞，可能是促进EMT和导致肿瘤转移的罪魁祸首。代谢重编程在肿瘤增殖和转移中也起着重要作用。作者通过生信分析推测iCAFs与脂质代谢相关（图3A），提示TME中iCAFs脂质代谢活性的变化可能是促进肿瘤发生的潜在机制。
图3 iCAFs通过改变肿瘤微环境促进肿瘤发生
4. 化疗改变肿瘤微环境
当作者整合两个患者的数据集时，作者发现了患者特定的ST表达模式（图4B），因此作者使用CCA来消除对ST数据的批量影响。值得注意的是colon1和colon2之间仍然存在明显的异质性（图4A），因此作者认为化疗药物可能是解释TME中差异表达谱的原因之一。详细地，作者分析了两名患者的细胞组成，结果显示在结肠2（NACT与PR），而一些抗肿瘤免疫细胞的比例下降，如：NK细胞、单核细胞等（图4C、图4D）。此外，作者还检查了化疗药物引起的代谢模式变化，作者发现结肠2的代谢活性显着降低（图4E）。然而，当作者关注富含iCAFs的簇时，作者检测到结肠2中的脂肪酸代谢活性没有降低（图4F），那么作者认为这种现象可能与iCAFs相关。或许，正是这些肿瘤杀伤细胞的减少和由iCAF引起的代谢模式改变才解释了耐药性的内部机制。
图4化疗会改变肿瘤微环境
5. iCAFs与临床预后和免疫浸润有关
为了将空间转录组学数据与公共数据集关联起来，作者评估了iCAF在TCGA-COAD-READ队列中的临床意义。临床病理学生信分析显示，iCAFs与淋巴结侵袭显着相关，iCAFs越高，淋巴结侵袭的可能性越大（图5A-D）。此外，使用单因素（图5E、F）和多因素Cox比例风险回归生信分析（图5G）来分析iCAF积累与预后的关系。调整混杂因素后的多因素生信分析表明，iCAFs的积累是OS的独立预后因素（图5G）。为了探索不同组织中iCAFs的差异表达，作者采用免疫组织化学方法专门检测了iCAFs标志物（PDGFRA）在肿瘤组织和癌旁组织中的表达，结果表明iCAFs在不同组织中的比例较高。肿瘤组织而不是癌旁组织（图5H）。这些结果进一步表明iCAF与预后不良有关。当作者关注iCAFs与免疫炎症的关系时，应用ESTIMATE算法计算TCGA队列的免疫评分和基质评分，结果显示iCAFs与免疫评分显着相关（图5I,J)，表明iCAFs可以与免疫抑制细胞相互作用，从而抑制TME中的抗肿瘤炎症反应。
图5 iCAFs与临床预后和免疫浸润有关
小结
作者确定了CRC中两种不同类型的CAF，并为CAF与肿瘤微环境之间的相互作用提供了深入的视角。该研究为今后针对CRC的药物治疗策略提供了一个切实可行的思路。
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