导语
今天给同学们分享一篇基因高表达激活信号通路诱导肿瘤EMT导致不良预后的生信文章“High CBX8 Expression Leads to Poor Prognosis in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma by Inducing EMT by Activating the Wnt/β-Catenin Signaling Pathway”这篇文章于2022年6月23日发表在Front Oncol期刊，IF=5.738。在这项研究中，CBX8在LSCC中高表达，通过激活Wnt/β-catenin信号通路诱导EMT（上皮间质转化）过程，促进LSCC细胞增殖和迁移，抑制凋亡，导致预后不良。
1. CBX8在各种癌症和LSCC组织中过度表达
在TCGA生信分析数据库中使用生信分析了CBX8基因在各种常见肿瘤和LSCC中的表达情况。CBX8基因在包括HNSCC在内的30种恶性肿瘤中高表达，在4种肿瘤中低表达（图1A）。根据TCGA的转录组数据，使用“limma”包的LSCC中CBX8mRNA的表达明显高于癌旁组织（P<0.001）（图1B）。同时收集中国医科大学附属盛接受全喉手术的30例LSCC患者的癌组织及其配对的癌旁组织，采用qRT-PCR方法检测CBX8mRNA的表达。因此，所得结果与TCGA生信分析数据库分析一致，差异显着（P<0.001）（图1C）。此外，IHC显示CBX8主要在肿瘤细胞核和细胞质中表达，其在LSCC中的表达（图1D，E）显着高于癌旁组织（图1F），在癌组织和癌旁组织中的阳性率分别为67.5%(27/40)和22.5%(9/40)（表1）。这些数据表明CBX8在LSCC中过表达。
图1 CBX8在LSCC组织中高表达
2. CBX8高表达导致LSCC患者预后不良
作者将111个TCGA肿瘤样本中CBX8的表达水平按照中位数（6.690479164）分为高表达组和低表达组。通过“survival”包获得的CBX8总生存率显示，CBX8高表达患者的生存时间比CBX8低表达患者的生存时间短（图2A）。接下来，作者使用GEO生信分析数据库进行验证，结论与之前的生信分析结果一致（图2B）。同时，从TCGA生信分析数据库中筛选出92例明确淋巴结分型的患者，作者的生物检测结果显示其表达水平也与淋巴结转移有关，早期患者的生存率高于晚期患者（图2C）。IHC得出同样的结论，有淋巴结转移的患者阳性表达率为92.31%，无淋巴结转移的患者阳性表达率为55.56%。LSCC组织中CBX8蛋白的表达水平也与患者的临床分期相关。STAGEI、II、III、IV组患者的阳性表达率分别为18.18%、86.21%，差异有统计学意义。同时，CBX8蛋白表达水平与患者的性别、年龄、吸烟、饮酒、病灶部位或分化程度均无相关性。
图2 CBX8蛋白表达与LSCC患者预后的关系
3. CBX8对LSCC增殖、迁移和侵袭能力的促进作用
为了观察CBX8对LSCC细胞生物学行为的影响，作者合成了CBX8siRNA，并以最高的敲低效率转染了AMC-HN-8和Hep2细胞。最后，作者观察到CBX8敲低后，AMC-HN-8和Hep2细胞中CBX8mRNA的表达显着降低。CCK-8结果显示，CBX8敲低后AMC-HN-8和Hep2细胞的增殖能力明显减弱（图3A、B）。EdU实验进一步验证了上述发现，CBX8-siRNA组EdU阳性细胞数量明显减少，也表明细胞增殖减弱（图3C、D）。在伤口愈合试验中，CBX8-siRNA组到伤口的迁移距离明显更短（图3E，F）。Transwell侵袭试验表明，在CBX8敲低后，细胞侵袭的数量显着减少（图3G，H）。
图3 敲低CBX8抑制LSCC细胞增殖、迁移和侵袭
4. 敲低CBX8可促进LSCC细胞凋亡
siRNA转染构建CBX8敲低模型，流式细胞仪（AnnexinV/PI法）检测细胞凋亡。结果显示，在si-CBX8组中，两种LSCC细胞系的凋亡率显着增加（图4A、B）。同时提取各组总蛋白，Westernblotting证实随着CBX8的下降，凋亡蛋白Bax的表达增加，Bcl2的表达减少（图4C，D）。此外，透射电镜显示，敲低CBX8表达后，AMC-HN-8和Hep2细胞的细胞核发生变形，线粒体明显受损，正常形态消失，形成大的空泡结构（图4E，F）。
图4 敲低CBX8可促进LSCC细胞凋亡和自噬
5. 敲低CBX8调节Wnt/β-连环蛋白信号通路
CTNNB1基因编码β-catenin蛋白，它是Wnt/β-catenin信号通路的重要调节蛋白(18)。TCGACO-AD数据集中CBX8和CTNNB1之间的相关性生信分析表明，CBX8与CTNNB1基因表达呈正相关（图5A）。为阐明CBX8促进细胞增殖的机制，作者通过KEGG富集生信分析寻找CBX8可能参与的通路，结果表明CBX8与Wnt信号通路相关（图5B）。基于此，作者检测到CBX8敲低细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的变化。结果表明，转染后AMC-HN-8和Hep2细胞中β-catenin蛋白的表达降低，而DKK1和GSK3β的表达增加（图5C，D）。这些结果表明，CBX8可能正向调节Wnt/β-catenin信号通路，促进LSCC细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡。
图5 CBX8敲低对Wnt/β-catenin信号通路的影响
6. 敲低CBX8调节EMT相关蛋白表达
相关研究证实，CBX8可通过调节EMT诱导肿瘤细胞增殖和迁移。作者检测到转染后EMT相关蛋白Snail1、E-catherine和N-cadherin的变化。蛋白质印迹生信分析清楚地表明，在CBX8敲低细胞中，E-Catherine（上皮标志物）显着增加，而N-钙粘蛋白和Snail1蛋白水平降低（图6A、B）。
图6 CBX8敲低对EMT相关蛋白的影响
小结
作者的研究分析了CBX8在LSCC和邻近正常黏膜组织中的表达及其与Wnt/β-catenin信号通路和EMT的关系。CBX8可能通过激活LSCC中Wnt/β-catenin信号通路调节β-catenin、DKK1、GSK3β和EMT相关蛋白的表达，从而增强LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制细胞凋亡，最终导致预后不良的患者。总体而言，CBX8可能与LSCC的诊断和治疗密切相关，但具体作用和机制有待进一步研究。对干湿结合生信分析癌症的生信思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询。
联系客服
