导语
今天给同学们分享一篇一种新型lncRNA促进肿瘤进展的生信文章“A novel lncRNA RP11-386G11.10 reprograms lipid metabolism to promote hepatocellular carcinoma progression”，这篇文章于2022年月5日发表在Mol Metab杂志上，IF=8.568。研究的结果表明lncRNA-RP11-386G11.10是一种新型致癌lncRNA，与HCC的不良预后密切相关。ZBTB7A-RP11-386G11.10-HNRNPU正反馈回路通过调节脂质合成代谢促进HCC的进展。RP11-386G11.10可能成为肝细胞癌（HCC）新诊断和预后生物标志物和治疗靶点。
1.lncRNA-RP11-386G11.10 在HCC组织和细胞系中显着上调
为了探索HCC相关lncRNA的作用，作者筛选了TCGA数据库并确定了一个新的lncRNA-RP11-386G11.10 ，它在所有类型的癌症和癌症中都过表达HCC中与预后相关的、保守的和非蛋白质编码的细胞系。作者生成了Kaplan-Meier生存曲线，发现RP11-386G11.10高表达的患者预后较差（图1A，图1B）。对80对HCC和非肿瘤组织的QRT-PCR生信分析以及按RP11-386G11.10表达分层的患者的生存分析证实了这一发现（图1C，图1D）。此外，单因素方差生信分析显示，HCC组织中RP11-386G11.10的表达与预后不良、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、巴塞罗那临床肝癌（BCLC）分期和门静脉呈正相关。静脉肿瘤血栓形成(PVTT)(图1E)。基于UCSC基因组浏览器数据库和编码潜力计算器2（CPC2）工具的生信分析表明，RP11-386G11.10是保守的且非蛋白质编码（图1D，图S1E）。作者使用5'-和3'-RACE生信分析来获得RP11-386G11.10的全长。接下来，与L02正常人肝细胞相比，发现HCC细胞（HepG2、Hep3B、Li7、Huh-7和HCC-LM3）中RP11-386G11.10mRNA水平上调，并且在Huh-7和HCC-中上调最多。LM3细胞（图1F）。此外，核质RNA分离和FISH结果显示RP11-386G11.10主要位于细胞质中（图1G，图1H）。作者的结果表明lncRNA-RP11-386G11.10 在HCC中上调，这种上调可能与HCC的进展有关。
图1 RP11-386G11.10表达在HCC中显着增加
2. lncRNA-RP11-386G11.10 在体内和体外促进HCC细胞增殖和转移
为了进一步阐明RP11-386G11.10的生物学功能，作者使用Huh-7和HCC-LM3细胞系建立了敲低模型（图2A）。细胞增殖测定表明，RP11-386G11.10敲低显着抑制了HCC细胞的增殖（图2B，图2C）。Transwell侵袭试验和伤口愈合试验结果表明，敲除RP11-386G11.10显着降低了HCC细胞的侵袭和迁移能力（图2D，图2E）。并且RP11-386G11.10过表达增加了细胞增殖、侵袭和迁移。为了进一步探索RP11-386G11.10在体内的作用，作者将shNC或RP11-386G11.10-sh2HCC-LM3细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中。与shNC组相比，RP11-386G11.10-sh2组的肿瘤体积和重量显着减少（图2F）。此外，IHC结果显示，敲除RP11-386G11.10显着降低了ki-67的表达（图2G）。作者还建立了体内转移模型，发现RP11-386G11.10-sh2组肺和肝转移结节较少（图2H，I）。综上所述，与shNC相比，该lncRNA在体内和体外均促进了HCC细胞的增殖和转移。
图2 RP11-386G11.10促进HCC增殖和转移
3. lncRNA-RP11-386G11.10 促进HCC发展并增加HCC中的从头脂质合成
为了彻底研究RP11-386G11.10调节HCC发生和发展的机制，作者进行了RNA-seq以鉴定Huh-7细胞中RP11-386G11.10敲低后的潜在基因。RNA-seq数据显示RP11-386G11.10敲低导致总共687个基因的差异表达，包括477个上调基因和210个下调基因（图3A）。热图显示了每个样本中所有差异表达基因的表达（图3B）。KEGG通路生信分析表明，脂肪酸代谢信号通路是最显着富集的通路之一（图3C）。然后作者下载了GESA的TCGA-LIHC数据集，发现与RP11-386G11.10共表达的基因在脂肪酸(FA)代谢中显着富集（图3D）。由于异常的脂质代谢被认为与HCC的进展有关，作者评估了RP11-386G11.10是否影响HCC细胞中的脂质代谢。与对照细胞相比，RP11-386G11.10敲低的HCC细胞中的甘油三酯和胆固醇水平显着降低（图3E）。气相色谱-质谱(GC-MS)结果表明，细胞内FAs的含量，如棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和油酸,被RP11-386G11.10击倒显着减少(图3F)。此外，如尼罗红染色所示，RP11-386G11.10敲低抑制了细胞内脂质积累（图3G）。接下来，作者确定了RP11-386G11.10调节HCC细胞异常脂质代谢的机制。作者检查了80个HCC组织样本中脂质代谢基因的mRNA水平。Pearson相关生信分析显示，一些脂质代谢基因的mRNA水平，包括脂肪生成酶脂肪酸合酶（FASN），ATP-柠檬酸裂解酶（ACLY）,乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)与RP11-386G11.10具有显着相关性(图3H)。qRT-PCR和westernbolt结果表明，敲除RP11-386G11.10降低了HCC细胞中FASN、ACC、ACLY和SCD等关键脂质合成基因的表达（图3I-J）。此外，参与脂质摄取、合成、β-氧化和输出的其他相关基因的表达没有显着变化。在过表达RP11-386G11.10的细胞中，观察到上述脂质代谢的相反变化。裸鼠皮下肿瘤的IHC生信分析表明，敲除RP11-386G11.10可降低体内FASN、ACC、ACLY、SCD和其他基因的蛋白表达（图3K）。总之，作者的结果表明，RP11-386G11.10促进了HCC细胞中的脂质积累。
图3 RP11-386G11.10促进HCC中的脂质合成
4. lncRNA-RP11-386G11.10 通过充当ceRNA负向调节miR-345-3p
LncRNAs通过多种不同的机制调节细胞生物学过程，大多数lncRNAs通过充当miRNAs的分子海绵来发挥其功能。因此，作者假设RP11-386G11.10也可能作为HCC中的ceRNA与miRNA相互作用。生物信息学数据库miRDB和LncBase用于预测RP11-386G11.10和miRNA之间可能的相互作用，预测RP11-386G11.10可能调节11种miRNA（图4A）。对公共TCGA数据集的生信分析表明，与配对的非肿瘤组织相比，HCC组织中5种miRNA的表达显着降低（图4B）。在RP11-386G11.10过表达或敲低后，miR-345-3p的表达表现出最明显的变化（图4C）。此外，对80个HCC组织的Pearson生信分析显示，RP11-386G11.10和miR-345-3p的表达呈显着负相关（图4D），表明RP11-386G11.10可能是miR-345-3p的ceRNA。为了证实上述推测，作者使用miRNA模拟物/抑制剂分别上调/敲低mi-345-3p的表达，并构建了WT和MUTRP11-386G11.10报告质粒（图4E）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，过表达miR-345-3p的RP11-386G11.10-WT细胞的相对荧光素酶活性与对照细胞相比显着降低，而敲低miR-345-3p显着增加RP11-386G11.10-WT细胞中的相对荧光素酶活性（图4F）。相反，在RP11-386G11.10-MUT细胞中未检测到此类变化（图4F）。此外，RIP生信分析显示RP11-386G11.10和mi-345-3p与沉淀复合物中的抗Ago2抗体结合，但不与IgG对照结合（图4G）。因此，作者的结果表明，RP11-386G11.10含有miR-345-3p的结合位点，并作为ceRNA负调控miR-345-3p。
图4 RP11-386G11.10直接与miR-345–3p结合并负调控miR-345–3p表达
5. MiR-345-3p抑制HCC进展
鉴于RP11-386G11.10可能通过海绵化miR-345-3p发挥作用，作者进一步研究了miR-345-3p的生物学功能。作者的结果表明，miR-345-3p过表达受到抑制，而miR-345-3p敲低促进了HCC细胞的细胞增殖、侵袭和迁移能力（图5A-D）。作者接下来使用皮下异种移植、尾静脉注射和脾内注射模型来探索miR-345-3p在体内的作用。miR-345-3p过表达组的肿瘤体积和重量均显着降低（图5E）。在尾静脉注射和脾内注射模型中，miR-345-3p敲低增强了肺和肝转移结节（图5F-G）。总之，这些结果表明miR-345-3p在体外和体内抑制HCC细胞的增殖和转移。
图5 MiR-345-3p抑制HCC中的增殖和转移以及脂质合成
6. miR-345-3p抑制HCC中的脂质合成
作者验证了RP11-386G11.10和miR-345-3p之间的相互作用，这表明miR-345-3p也可能影响HCC中的脂质合成。尼罗红染色和HCC细胞中甘油三酯和胆固醇水平的测量结果表明，miR-345-3p的过表达/敲低分别抑制/促进了HCC细胞中的脂质积累（图5H）。qRT-PCR和蛋白质印迹结果显示，合成代谢基因的表达分别被miR-345-3p过表达/敲低下调/上调（图5I，图5J）。上述结果表明miR-345-3p可以延缓HCC的进展并抑制脂质合成代谢。
7. HNRNPU是miR-345-3p的直接靶基因
为了明确miR-345-3p的直接靶基因，作者使用生信分析预测了17个可能参与HCC发生和发展的靶基因（图6A），其中只有VPS4B和HNRNPU已被报道促进HCC的发展。qRT-PCR和蛋白质印迹结果显示miR-345-3p过表达/敲低可以下调/上调HNRNPUmRNA和蛋白质表达，而VPS4B表达没有显着变化（图6B，图6C）。对80个HCC组织的Pearson相关生信分析表明，miR-345-3p的表达与HNRNPU的表达呈负相关（图6D）。然后，为了阐明HNRNPU是否直接受miR-345-3p调控，作者构建了WT和MUTHNRNPU质粒，发现miR-345-3p模拟转染显着降低了HNRNPU-WT细胞的相对荧光素酶活性，而miR-345-3p抑制剂转染显示相反的效果（图6E，图6F）。相反，在HNRNPU-MUT细胞中未检测到此类变化（图6F）。此外，RIP检测结果显示miR-345-3p和HNRNPU与沉淀复合物中的抗Ago2抗体结合，但不与IgG对照结合（图6G）。上述结果表明，miR-345-3p可以与HNRNPU中的靶位点结合，直接调控HNRNPU。
图6 MiR-345–3p直接与HNRNPU结合并负调节HNRNPU表达
8.lncRNA-RP11-386G11.10通过miR-345-3p/HNRNPU轴促进HCC细胞生长和转移
如先前文献报道，HNRNPU通过促进脂质合成来促进HCC细胞的增殖和转移。如对TCGA-LIHC数据集的生信分析所示，HNRNPU在HCC中高表达并与不良预后相关。为了阐明RP11-386G11.10是否通过miR-345-3p/HNRNPU轴调节HCC细胞中HCC和脂质合成代谢的进展，作者将miR-345-3p抑制剂或HNRNPU质粒转移到RP11-386G11.10敲低HCC中细胞。通过敲低RP11-386G11.10降低了HNRNPU表达，并且正如预期的那样，这种抑制被miR-345-3p抑制剂逆转。结果表明，miR-345-3p敲低和HNRNPU过表达都逆转了RP11-386G11.10敲低诱导的HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低（图7B-E）。然后作者将miR-345-3p抑制剂和HNRNPU质粒转移到RP11-386G11.10敲低细胞中，并通过皮下注射将这些细胞植入BALB/c裸鼠中。与shNC组相比，MiR-345-3p抑制或HNRNPU过表达逆转了RP11-386G11.10-sh2组中肿瘤体积和重量的显着减少（图6F）。这些结果表明RP11-386G11.10作为miR-345-3p的ceRNA调节HNRNPU的表达，导致HCC的发展。
图7 RP11-386G11.10通过miR-345–3p/HNRNPU轴促进HCC中的细胞生长和转移以及脂质合成
9. RP11-386G11.10、miR-345-3p、HNRNPU轴介导的脂质代谢是HCC进展的原因
作者观察到肿瘤切片中RP11-386G11.10敲低引起的脂质水平降低被miR-345-3p抑制剂转染和HNRNPU过表达逆转（图7G，图7H）。此外，miR-345-3p抑制和HNRNPU过表达都逆转了RP11-386G11.10敲低诱导的关键脂质合成基因（如FASN、ACC、ACLY和SCD）的mRNA和蛋白质表达下调（图7I，图7J）。在HCC细胞系中也观察到相同的变化。这些结果表明，RP11-386G11.10通过由miR-345-3p/HNRNPU轴调节的脂质合成代谢促进HCC细胞的生长和转移。
10. ZBTB7A是lncRNA-RP11-386G11.10 的转录因子
最后，为了阐明RP11-386G11.10在HCC中的过表达，作者使用hTFtarget、geneCARDS和UCSCGenomeBrowser数据库预测TATA-box结合蛋白(TBP)和ZBTB7A可能是调节RP11-386G11.10的转录因子（图8A），作者发现两种TF在HCC组织中均过表达。击倒ZBTB7A显着降低了RP11-386G11.10的表达（图8B）。然而，RP11-386G11.10表达在TBP敲低后没有显着变化。为了验证ZBTB7A对RP11-386G11.10发挥转录调控作用，作者根据启动子生信分析工具预测的RP11-386G11.10和ZBTB7A结合位点(GGCGCCCACCAC)的序列构建了WT和MUTRP11-386G11.10质粒（UCSC和JASPAR）（图8C）。然后，作者用HCC细胞构建了ZBTB7A过表达模型，发现ZBTB7A过表达显着增加了RP11-386G11.10-WT细胞的相对荧光素酶活性，而ZBTB7A敲低则显示出相反的效果（图8D）。相反，在RP11-386G11.10-MUT细胞中未检测到此类变化（图8D）。此外，ChIP-qPCR的结果进一步证实ZBTB7A直接与RP11-386G11.10的启动子区域结合（图8E）。
图8 RP11-386G11.10直接受转录因子ZBTB7A调控
11. HNRNPU形成一个正反馈回路，通过激活ZBTB7A促进lncRNA-RP11-386G11.10 的表达
基于RP11-386G11.10、ZBTB7A和HNRNPU在HCC中高表达的研究结果，并且三者之间存在强相关性，作者假设RP11-386G11.10对HCC的强促进作用进展和脂质合成是由于潜在的正反馈循环。HNRNPU敲低降低了ZBTB7A的mRNA和蛋白质表达水平以及RP11-386G11.10的mRNA表达水平（图8F-G）。据报道，HNRNPU通过稳定下游靶基因mRNA促进癌症进展，并且作者观察到在HNRNPU敲低后，HCC细胞中ZBTB7AmRNA的稳定性如预期的那样降低（图8H）。此外，HNRNPU过表达增加了RP11-386G11.10-WT细胞的相对荧光素酶活性（图8I）。ZBTB7A敲低逆转了HNRNPU过表达对RP11-386G11.10-WT细胞的影响，但在RP11-386G11.10-MUT细胞中未观察到显着变化，这表明HNRNPU促进了ZBTB7A与RP11-386G11.10的结合启动子区域（图8I）。此外，ZBTB7A或HNRNPU的过表达增强了RP11-386G11.10的表达，并且这种效应被ZBTB7A的敲低逆转，在荧光素酶报告基因检测中观察到相同的趋势。上述结果表明，HNRNPU通过形成激活RP11-386G11.10的正反馈环来稳定ZBTB7AmRNA以促进HCC进展和脂质积累。
总结
总之，作者提出了 lncRNA 介导的 HCC 进展中脂质代谢重编程的新机制，并扩大了对 lncRNA 介导的 HCC 代谢稳态调节的理解。此外，由于脂肪生成在正常细胞中并不常见，因此针对脂肪生成酶及其信号级联的方法对于开发用于癌症治疗的创新药物非常有希望。从这个角度来看，作者的研究为HCC提供了可能的预后指标，并为开发新的HCC治疗药物和策略铺平了道路。对lncRNA的生信思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询。
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