导语
今天给同学们分享一篇非肿瘤microRNA 和 DNA 甲基化的生信文章“Epigenetic alternations of microRNAs and DNA methylation contribute to gestational diabetes mellitus”，这篇文章于2022年10月21日发表在J Cell Mol Med期刊上，影响因子为5.295。这项研究确定了一系列与 GDM 中 miRNA 和 DNA 甲基化的表观遗传变化相关的差异表达基因。十种化学物质和四个关键基因可能分别作为 GDM 诊断和治疗的潜在药物和靶点进一步探索。
1. GDM异常甲基化差异表达基因的微阵列数据信息及鉴定
在GSE103552中，GDM的AEC样本中共鉴定出5212个DEG，包括2095个上调基因和3117个下调基因。同时，在GSE104297的miRNAs数据集中筛选出16个高表达的miRNAs和12个低表达的miRNAs。对于基因甲基化，在GSE106099中发现了位于4553个基因中的7387个低甲基化CpG位点和位于5607个基因中的10010个高甲基化CpG位点。每个常染色体的所有差异甲基化CpG位点都显示在图1A中。六个不同基因组亚区域中差异甲基化CpG位点的分布如图1B所示。此外，差异甲基化基因(DMG)均匀分布在常染色体上（图1C）。
图1 DEG和DMG的差异DNA甲基化分布和层次聚类热图
最后，通过相交的DEG和DEM的靶基因，鉴定了184个低miRNA靶向上调基因和234个高miRNA靶向下调基因，除了has-miR-191-3p，它没有交集的靶向基因（图2A）。此外，通过交集的异常甲基化和调节基因获得了364个低甲基化高表达基因和541个高甲基化低表达基因（图2B）。此外，图1D和1E显示了前40个DEG和DMG（20个上调基因和20个下调基因以及20个高甲基化和低甲基化基因）的热图，这表明它们可以区分GDM和正常。
图2 鉴定GDM和健康样本之间差异表达的miRNA和mRNA的靶基因以及异常甲基化的差异表达基因
2. 与microRNA异常表达相关的功能富集分析
上调基因和低表达miRN功能富集分析确定了28个满足P值<0.05阈值的基因通路，这些通路主要与转录调控和金属离子结合（图3A）。KEGG通路富集分析显示，这些基因在轴突导向、扩张型心肌病、cGMP-PKG信号通路和内吞作用等通路中显着富集。为了进一步确定在GDM进展中受调节的重要miRNA/mRNA，构建了miRNA-mRNA网络（图3B）。ZBTB20、RASA1、POU2F1、NFAT5和PDE1C被三种miRNA和SATB2、DICER1、ZBTB10、TNRC6B、LASP1、VPS53、ZNF264、MAFG、SRGAP1、RAPGEF2、OGT、NEDD9、NAV2、KDM5A、TET2、CAMSAP2、XRN1、SUN1、KIAA1549L、MED13、KLF6、ZXDC和APBB2被两个miRNA靶向。低表达miRNA和上调基因的KEGG富集气泡图如图3E所示。
图3 miRNA靶向DEG的可视化调控网络和富集气泡图
3. 下调基因和高表达miRNA
高表达miRNA靶向下调基因的富集分析表明，45个GO通路被识别为P值<0.05的阈值，这主要与细胞分裂和蛋白质结合有关（图3C）。最丰富的KEGG分析通路是嘌呤代谢、代谢途径、抗生素生物合成、类固醇生物合成和错配修复（图3E）。从miRNA-mRNA网络中，共有14个基因受两个miRNA调控，TNFRSF9、ST8SIA4、IPMK和RSBN1L受三个miRNA调控（图3D）。在miRWalk中没有预测到交集的has-miR-191-3p显着靶基因。
4. DEG与DNA甲基化和异常microRNA表达有关
高表达和低甲基化基因总共364个低甲基化-高表达基因在116个GO富集项中富集，例如信号转导和细胞迁移（图4A）。KEGG通路分析表明通路在癌症、粘着斑和ECM受体相互作用中的富集（图4A）。PPI网络中总共显示了532个节点和1153个边（图4B）。按程度排序的前十个基因被确定为关键基因，包括ABL1、COL4A2、FBN1、LAMB2、LTBP1、POLR2A、RHOT2、SDC2、TGOLN2和VHL。在这10个关键基因中，POLR2A的度数最高。此外，为了研究PPI网络中发现的重要模块，MCODE插件选择了前两个重要模块，得分分别为8.00和6.27（图4E），以及模块中涉及的基因的功能注释，使用PANTHER进行分析。GO分析表明，模块1和模块2主要分别与细胞外基质中的TGFbeta和蛋白质多聚泛素化相关。此外，Reactome通路分析富集了翻译后蛋白磷酸化和neddylation通路中的模块1和模块2基因。
图4 甲基化相关DEG的PPI网络和富集条形图
5. 与DNA甲基化和异常miRNA相关的DEG
ABCE1、ANKRD46、ANP32E和ATG7等67个基因在低甲基化和减少的miRNA的调节下被上调（图5A）。同时，48个基因，包括SPATS2、SERPINE1、TACC1、ADD1和NEK6，在高甲基化和增加的miRNA的调节下被下调（图5B）。为了清楚地阐明对整个人类基因组尤其是所有胚胎细胞阶段和胎盘组织中上调和下调基因表达的更深入见解，使用并建立了交集DEG的代表性表达热图（67个上调基因和48个下调基因）（图5F和图5G）。在上调的66个基因中，SERPINE1、FBN1和DICER1在胎盘中的表达水平最高。在下调的44个基因中，SRP19、SRP68和UBE2I在胎盘中的表达水平最高。将115个基因（包括67个低miRNA靶向上调低甲基化基因和48个高miRNA靶向下调高甲基化基因）提交给CMap，以根据表达改变预测GDM治疗中的潜在药物。通过按降序排列连通性分数，前4种化学物质被确定为GDM的潜在治疗选择。此外，构建了所有交集异常表达基因的PPI网络，包括上调的67个基因和48个下调的基因（图5C）。筛选了来自PPI的四个关键基因（图5C）以供进一步分析，包括三个在低甲基化和低miRNA调节下表达水平上调的基因RANBP2、DICER1和IGF1R，以及在两者下表达水平下调的ATG7高甲基化和高miRNA调节。miRNA和DNA甲基化调节4个选定基因表达的代表性表观遗传调控模式如图6A-D所示。接下来，进行了CpG预测分析（图6A-D）。RANBP2和IGF1R分别有4个和3个预测的CpG。DICER1和ATG7都有2个预测的CpG。此外，通过CisGenomeBrowser（图6E），IGF1R启动子区域中具有代表性的4个CpG结合转录因子被鉴定为在DMR中富集。
图5 交集基因
图6 CpG预测分析
总结
这项研究指出了一系列异常甲基化的差异表达基因，这些基因与GDM中miRNA和DNA甲基化的表观遗传改变有关。通过交集DEGs和DEMs靶标获得了184个低miRNA靶向上调基因和234个高miRNA靶向下调基因，它们分别富集在cGMP-PKG信号通路和嘌呤代谢中。此外，364个低甲基化和上调基因交集的低甲基化高表达基因，以及541个高甲基化和下调基因交集的高甲基化低表达基因，与ECM受体相互作用和蛋白酶体有关。有趣的是，67个基因在miRNA减少和低甲基化的调节下上调，而48个基因在miRNA增加和高甲基化的调节下下调。十种化学物质被确定为GDM的治疗剂。此外，从这些基因来看，ATG7、DICER1、IGF1R和RANBP2可能在妊娠期糖尿病的发生和发展中发挥重要作用，并可能作为基于异常甲基化或miRNA靶向表达的生物标志物在未来用于GDM的精准诊断和治疗。
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