导语
今天给同学们分享一篇与M2巨噬细胞相关分析找到提高黑色素瘤免疫治疗疗效的潜在靶点的生信文章“Transcriptome-based network analysis related to M2-like tumor-associated macrophage infiltration identified VARS1 as a potential target for improving melanoma immunotherapy efficacy”，这篇文章于2022年10月27日发表在J Transl Med期刊上，影响因子为8.44。为了对黑色素瘤患者M2-like TAM浸润的分子特征提供新的见解，作者根据癌症基因组图谱中与M2-like TAM浸润最正相关的基因模块确定了两个不同的聚类。然后，作者研究了两个聚类之间在预后、多组学和功能富集方面的差异。接下来，作者根据两个聚类的差异表达基因(DEG)构建了预后模型，并比较了高风险和低风险组的预后、免疫细胞浸润、免疫相关基因谱和免疫治疗反应。
1. 识别M2-like TAM相关模块
首先，作者使用CIBERSORT算法评估患者免疫细胞浸润的比例。在TCGA和GSE98394数据集中，M2巨噬细胞浸润比例较高的患者预后较差（图1A）。考虑到更多的M2巨噬细胞似乎与较差的预后和CD8T细胞浸润相关，作者进行了WGCNA以检测与CD8T细胞和M2巨噬细胞浸润相关的模块。作者选择软阈值功率β=5来构建无标度网络。热图表明yellow模块分别与TCGA-SKCM中CD8+T细胞和M2巨噬细胞的浸润呈负相关和正相关（图1B）。作者使用yellow模块中的基因和TCGA-SKCM数据集中的生存数据进行单因素Cox回归分析，在TCGA-SKCM中有125个基因与OS相关。作者使用RConsensus聚类Plus包基于125个预后基因在TCGA-SKCM数据集中进行一致聚类，并确定了两个聚类：聚类1（319例）和聚类2（148例）（图1C）。主成分分析还表明这两个群体是不同的群体（图S1G）。聚类1的OS结果比聚类2差（图1D）。
图1 识别M2-like TAM相关模块
2. 功能和多组学分析
为了证明每个聚类中的信号通路激活，作者使用MSigDBv7.4中的KEGG信号通路基因集计算了GSVA富集分数。图2A描绘了每个聚类中排名前20的富集途径。与聚类2相比，聚类1的特点是缺乏免疫相关通路，例如T细胞受体信号通路。之前的一项研究将TCGA-SKCM肿瘤分为三种亚型[1]：(1)免疫亚型，(2)角蛋白亚型，和(3)MITF低亚型。作者发现与聚类2相比，聚类1包含更高比例的角蛋白亚型（57%对13%）和更低比例的免疫亚型（34.7%对56.2%）（图2B）。
图2 两个聚类的功能分析和差异表达分析
GSEA表明M2巨噬细胞途径在聚类1中富集（图2C）。检查免疫检查点基因的差异表达表明，与聚类1相比，聚类2表现出更高的免疫检查点相关基因表达（图2D）。为了研究每个聚类中的突变，作者用瀑布图突出显示了两个聚类中前20个显着突变的基因(SMG)（图3A、3B）。聚类1包含独特的SMG，包括XIRP2、FAT4、USH2A和ANK3，而聚类2包含独特的SMG，包括FLG、APOB和CSMD2。
图3 两个聚类的突变分析
最近的一项前瞻性研究发现，较高的肿瘤突变负荷(TMB)与更好的免疫治疗反应相关。作者使用GISTIC2.0分析体细胞拷贝数变异(SCNV)并总结了聚类1和聚类2的扩增和缺失区域。聚类1总共包含56个焦点缺失峰和69个焦点放大峰，而聚类2包含37个焦点缺失峰和28个焦点放大峰（图4A、4B）。检查每个亚型中免疫检查点基因扩增或缺失的频率显示，聚类2包含更多的免疫检查点（VTCN1、TNFRSF家族）扩增和效应T细胞功能基因（GZMK、GZMA、IFNG），而聚类1有更多的缺失（VTCN1、ADORA2A、TJP1、IDO1、HAVCR2)（图4A、4B）。作者使用FDR<0.05的RChAMP包来分析两个聚类中的甲基化差异，并在聚类1和聚类2之间获得了28,870个差异甲基化探针(DMP)。有趣的是，聚类1的CD8A和HAVCR2甲基化水平增加比集群2中的要多（图4C）。
图4 两个聚类的多组学分析
3. M2巨噬细胞聚类相关预后模型的构建
作者探索了两个集群之间的DEGs以构建一个预后模型（图5A）。首先，作者对DEGs进行了单因素Cox分析，获得了3390个具有预后意义的基因。然后，作者基于3390个基因进行Lasso回归和多因素Cox分析，以在TCGA-SKCM数据集中构建预后模型。然后，根据风险评分将TCGA-SKCM患者分为高风险组和低风险组。风险评分较高的患者OS预后较差，而第1类患者的风险评分较高（图5BC）。为了验证模型的预后意义，作者使用相同的模型评分阈值计算验证队列（GSE65904）中的风险评分，结果相似，风险评分较高的患者OS较差，风险评分有预后价值（图5E、F）。
图5 M2巨噬细胞聚类相关预后模型的构建
4. 高危与低危人群免疫细胞浸润及免疫基因表达差异
为了评估M2巨噬细胞聚类相关风险评分对肿瘤微环境(TME)的影响，作者比较了高分组和低分组之间的免疫细胞浸润。与低风险评分患者相比，高风险评分患者的M2巨噬细胞浸润增加，CD8T细胞浸润减少（图5G）。作者还探讨了TCGA和GEO数据集中高风险评分组和低风险评分组中HLA家族基因和免疫检查点标记物表达的差异。与TCGA数据集的低风险评分组相比，高风险评分组的抗原呈递和免疫检查点相关基因的表达显着增加（图6A-C）。与这些结果一致，对GSE65904-like本数据的分析产生了类似的结果（图S3A–C）。此外，作者将M2巨噬细胞聚类相关模型应用于具有可用免疫治疗结果的合并数据集（GSE78220和GSE91061），并检查了黑色素瘤患者的风险评分。为了进一步观察高风险评分和低风险评分组对免疫治疗的不同反应，作者发现与低风险评分患者相比，高风险评分患者对免疫治疗无反应的比例更高(图6D)。
图6 高、低危人群免疫检查点相关基因及对抗PD-1免疫治疗反应的差异
5. VARS1作为yellow模块的关键基因及其在黑色素瘤进展和巨噬细胞极化中的作用
作者探索了yellow模块中的关键基因。作者使用yellow模块中的275个基因，根据STRING数据库结果构建了PPI网络。然后，通过CytoscapecytoHubba插件中的Closeness、Stress和Radality算法确定关键基因。黑色素瘤细胞生长所必需的关键基因是用DepMap确定的，通过对从这四种方法获得的基因集进行交集，仅识别出VARS1（图7A）。在TCGA数据集中，高VARS1表达与较短的OS相关（图7B）。此外，作者探讨了哪种细胞类型在黑色素瘤中主要表达VARS1。GSE115978数据集的单细胞RNA-seq结果表明，VARS1主要在肿瘤细胞中表达，但在基质细胞和免疫细胞中不表达（图7C）。此外，高风险评分患者的VARS1表达水平高于低风险评分患者。作者还检查了VARS1是否在黑色素瘤进展中发挥重要作用，并构建了VARS1过表达和VARS1敲低A375和SK-MEL-28细胞系。VARS1过表达促进细胞的迁移和侵袭能力，而VARS1抑制显着降低它（图7D-F）。GSEA表明，高VARS1水平与TCGA-SKCM数据集中的转移相关通路正相关（图7G）。此外，对人类蛋白质图谱(HPA)数据库的搜索显示，与正常皮肤组织相比，原发性黑色素瘤中VARS1表达增加，并且在转移性黑色素瘤中进一步增加。
图7 VARS1作为关键基因及其在黑色素瘤进展中的作用
6. VARS1与免疫浸润和诱导的M2巨噬细胞极化呈负相关
为了研究VARS1相关通路，作者根据VARS1基因表达的中值将TCGA-SKCM数据集患者分为两组。KEGG通路的GSVA显示，免疫相关通路，如T细胞受体通路，在VARS1低表达患者中富集，而肿瘤生长通路如细胞周期通路和mTOR通路在高表达患者中富集VARS1表达（图8A）。作者检查了VARS1表达与CIBERSORT免疫细胞浸润评分之间的相关性。VARS1表达与瘤内M2巨噬细胞浸润呈正相关，与M1巨噬细胞和CD8T细胞浸润呈负相关（图8B、C）。为了阐明VARS1在M2巨噬细胞极化中的作用，用过表达VARS1的A375细胞系(VARS1-A375)和A375载体(vector-A375)细胞系的上清液处理THP1细胞，并检测M1和M2巨噬细胞标记物。流式细胞术显示，与用载体-A375上清液处理的细胞相比，用VARS1-A375上清液处理的THP1细胞中M2巨噬细胞标记物CD206的表达增加了3倍，而M1巨噬细胞标记物CD86的表达降低了15.2%（图8D）。总之，这些结果表明VARS1可能在M2巨噬细胞浸润和极化中发挥重要作用。
图8 VARS1在免疫细胞浸润和巨噬细胞极化中的作用
7. VARS1在免疫细胞浸润和巨噬细胞极化中的作用
高VARS1表达与TCGA-SKCM数据集中的CD8T细胞浸润呈负相关（图9A）。许多免疫检查点基因的表达与TCGA和GSE65904数据集中的VARS1表达呈负相关（图9B）。之前的研究表明，TGF-β1参与PD-1免疫治疗耐药和M2巨噬细胞极化。在此，酶联免疫吸附测定表明，与载体细胞相比，VARS1过表达细胞的上清液中TGF-β1浓度显着增加。作者进行了SubMap分析以评估高和低VARS1表达的黑色素瘤患者的抗PD-1免疫治疗反应。结果表明，低VARS1表达预测抗PD-1免疫疗法的部分反应(PR)，而高VARS1表达预测抗PD-1免疫疗法的抗性(SD)（图9C）。为了探索VARS1在免疫调节中的抑制作用，作者使用不同的算法来研究Pan-TCGA数据集中VARS1基因表达与CD8T细胞浸润之间的相关性。热图显示VARS1基因表达和CD8T细胞浸润在大多数癌症中呈负相关（图9D）。
图9 VARS1的高表达与低CD8T细胞浸润相关并预测ICB的临床获益不佳
GSEA表明，许多免疫相关通路，例如T细胞介导的细胞毒性通路，在70%的癌症类型中具有高VARS1表达的患者中得到富集（图9E）。最后，作者评估了VARS1与OS在33种癌症类型之间的关联。VARS1高表达与六种癌症类型的较差生存相关，包括KICH、MESO、SKCM、SARC、LAML、CESC、READ。这些结果表明VARS1可能对患者预后和PD-1免疫疗法疗效具有预测价值。
总结
作者建立了黑色素瘤M2-like TAM相关预后模型，并探讨了VARS1在黑色素瘤进展、M2型巨噬细胞极化和免疫治疗耐药性发展中的作用。
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