导语
今天给同学们分享一篇构建lncRNA预后模型和验证的生信文章“Development and verification of a 7-lncRNA prognostic model based on tumor immunity for patients with ovarian cancer”，这篇文章于2023年2月4日发布在J Ovarian Res期刊上，影响因子为5.506。免疫反应和lncRNA在卵巢癌(OC)的增殖、侵袭和转移中均起着重要作用。在研究中，我们旨在为OC患者构建免疫相关lncRNA风险模型。
1.OC两种亚型的鉴定与初步评价
根据TCGA-OC队列中379个肿瘤样本的免疫学特征，基于29个免疫基因集结合ssGSEA算法将其分为高免疫组（Immunity_H）和低免疫组（Immunity_L）。R包（“estimate”、“limma”）用于计算两种亚型的免疫评分、基质评分、估计评分和肿瘤纯度（图1A）。基于ESTIMATE算法和ssGSEA的免疫反应热图如图1B所示。我们进一步使用tSNE算法对TCGA-OC进行聚类分析，得到了相似的分类结果（图1C）。此外，结果显示Immunity_H的ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore高于Immunity_L。此外，小提琴图还显示两种亚型之间的免疫评分、基质评分和估计评分存在显着差异（图1D）。我们进一步探索了两种亚型之间HLA基因的表达，发现Immunity_H中所有HLA基因的表达均显着高于Immunity_L（图1E）。这些结果说明了我们将OC分为两个亚型的重要性，这可以在很大程度上区分OC的特征。
图1 OC患者的免疫亚型和聚集
2. WGANA检测免疫相关模块和关键基因
在WGCNA分析中，我们确定了13个共表达模块，并分析了它们与来自ssGSEA的免疫相关集群的关联。基于lncRNA，通过R包“WGCNA”建立了共表达网络，可以揭示与免疫集群显着相关的模块和基因（图2A）。在本研究中，β=5是构建无标度网络的软阈值的最佳选择（图2B）。我们接下来用元模块可视化基因网络（图2C）。在调整WGCNA的参数后，我们将DEGs分为13个模块（图2D）。结果表明，紫色模块是免疫集群中最相关的模块（r=0.69，P=7e-34，图2E）。紫色模块中有141个基因。在模块性状分析中，8个GS>0.3和MM>0.8的基因被定义为关键基因：CCDC69、CLMP、FAM110B、FAM129A、GUCY1B3、PALLD、PLEKHO1和STY11。之后，我们将紫色模块中的基因定义为与干性相关的关键基因（图2F）。这些结果表明，紫色模块中的基因与OC细胞的干性显着相关。
图2 WGCNA对免疫相关模块的检测和验证
3. lncRNA相关基因的功能及DEGs
接下来，我们对WGCNA产生的关键lncRNA进行了相关性分析。最后，确定了1269个基因。然后对所选基因进行功能注释分析。GO富集显示lncRNA相关基因主要涉及“自噬”、“利用自噬机制的过程”、“转录调节复合体”、“黏着斑”、“蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性”（图3A）。KEGG通路富集分析显示，目标基因主要涉及“MAPK信号通路”、“癌症中的微小RNA”和“人类巨细胞病毒感染”（图3B）。同时，我们比较了相关基因在正常组织和癌组织之间的DEGs。共鉴定出72个DEG，包括31个下调基因和41个上调基因（图3C）。DEG的热图如图3D所示。这些结果表明关键基因在OC细胞的进展中发挥作用。
图3 免疫相关lncRNA的富集分析及差异表达基因
4. 选定关键基因表达谱的共识聚类分析
然后，我们进行了共识聚类分析以研究这些预后基因与OC亚型之间的关系。根据CDF值，我们将379名OC患者分为三类（图4A-D）。聚类1(n=226)、聚类2(n=80)和聚类3(n=73)是从总共379名患者中生成的。我们使用主成分分析(PCA)来显示三个亚组之间基因表达水平的差异（图4E）。我们还发现，来自第2组的患者往往比来自第1组和第3组的患者存活时间更长（图4F），这意味着这些DEG具有重要的预后价值。
图4 使用与预后相关的DEG鉴定OC患者的分子亚型
5. 基于lncRNA表达的风险特征的建立和验证
然后，我们通过紫色模块产生的lncRNA构建了一个风险模型。首先，我们选择这些基因对136个lncRNA进行额外的LASSO回归分析（图5A-B）。评估TCGA中OC患者的风险评分，根据中位风险评分将所有患者分为高风险组和低风险组（图5C）。毫无疑问，高风险组的死亡率明显高于低风险组（图5D）。热图中显示了7种lncRNA的差异表达水平和高风险组和低风险组的临床病理学特征（图5E）。结果显示，生存状态、肿瘤残留病灶、肿瘤状态、复发、等级、分期和肿瘤细分在两个风险组中存在差异分布。还进行了相关性分析以检查关键基因之间的表达相关性（图5F）。为了评估7-lncRNA特征在OC中的作用，我们绘制了TCGA-OC队列的高风险和低风险组的K-M曲线（图5G）。这两个亚组的OS存在显着差异(P<0.01)。此后，我们使用ROC曲线来预测风险特征的有效性。预测模型的ROC曲线下面积(AUC)是OS的0.72（图5H）。还比较了不同免疫组中7种lncRNA的含量。我们还在体外和体内验证了PSMB8-AS1在SKOV3细胞系中的功能。敲低PSMB8-AS1后转移能力显着降低。这些结果表明这7种lncRNA在卵巢癌的进展中起着重要作用。
图5 TCGA队列中免疫相关lncRNA风险模型的构建
6. 风险评分模型的功能分析
我们进一步研究了风险评分与ESTIMATE相关评分（包括免疫评分、基质评分和估计评分）之间的相关性。我们发现免疫评分、基质评分和风险评分之间呈低正相关（图6A-B），这表明基质和免疫细胞在高风险中较高。然而，肿瘤纯度与风险评分之间的关系呈负相关（图6C）。这些结果表明，高危组患者预后不良与OC肿瘤免疫微环境的变化有关。为了阐明与风险签名相关的签名丰富的重要途径，我们进行了GSEA。最后，确定了55个在低风险和高风险组之间具有显着差异的富集途径。高危组前5位信号通路依次为钙信号通路、细胞周期、脂肪酸代谢、GnRH信号通路和错配修复。另一方面，低风险组中排名前五的信号通路是P53信号通路、嘧啶代谢、调节pf肌动蛋白细胞骨架、TGF-β信号通路和紧密连接（图6D）。此外，我们根据免疫评分和风险评分将患者分为四个亚组。结果表明，免疫评分高、风险评分低的患者预后最好。然而，具有高免疫评分和高风险评分的患者预后最差（图6E）。这些结果表明ESTIMATE评分和风险评分之间的关系是显着的，风险评分模型的潜在功能也很有意义。
图6 肿瘤微环境与风险评分的关系
7. 预后列线图模型的构建和验证
接下来，我们对TCGA-OC患者进行了单因素和多因素Cox回归分析，以评估lncRNA相关风险特征的独立预后价值。我们观察到，在单因素分析中，年龄、分期、肿瘤状态、肿瘤残留和风险评分与预后显着相关（图7A）。此外，多因素分析表明，年龄、肿瘤状态、肿瘤残留和风险评分是TCGA-OC患者的独立预后因素（图7B）。建立了基于四个独立风险因素的列线图模型，以评估OC患者风险特征的预后意义（图7C）。校准曲线揭示了预期存活率和观察到的存活率之间的良好一致性（图7D）。然后根据诺模图的总分将OC患者平均分为三个亚组，即低分、中分和高分组。三组的总生存曲线如图7E所示。结果显示，得分高的患者预后最差。此外，ROC显示列线图可以准确预测患者的生存结果，1年、3年和5年的AUC值分别为0.780、0.823和0.837（图7F）。综上所述，上述结果表明列线图模型在预测OC患者的OS方面具有良好的可靠性。
图7 基于免疫相关lncRNA特征和临床病理学特征构建和验证列线图
8. GEO数据库中lncRNA相关风险特征的验证
为了评估风险模型的预测价值，我们在GSE数据集中使用了风险评分算法。验证队列的结果显示，与低风险组相比，高风险组中的OC患者在GSE17260（图8A-B）和GSE14764（图8C）中的OS和PFS率更差。存活的AUC分别为0.774、0.759和0.786（图8D-F）。这些发现表明，7-lncRNA风险模型可以准确预测OC患者的预后。
图8 在两个独立队列中验证免疫相关特征
9. 化疗药物敏感性分析与验证
为了观察不同风险组之间常用化学治疗药物的药物敏感性差异，使用药物选择。“pRPhic”包是一种用于预测某些化疗药物敏感性的方法。通过使用“pRRophetic”包进行药物敏感性分析，我们观察到高危组患者对雷帕霉素更敏感（图9A）。SKOV3来源于卵巢癌患者的腹水分离细胞。它对包括顺铂和阿霉素在内的一些化疗药物具有耐药性。A2780与SKOV3细胞系相似。因此，我们通过SKOV3和A2780细胞系的体内实验进一步验证了雷帕霉素的功能。Transwell和伤口愈合实验表明雷帕霉素抑制OC细胞系中的侵袭和转移（图9B-C）。
图9 雷帕霉素在OC细胞系中的体外验证
总结
总之，这项研究表明，一个由7个lncRNA组成的特征对OC的早期诊断和预后监测具有潜在的临床价值，可用于OC患者的预后预测，风险评分越高表明预后越差。基于这些lncRNA的潜在机制的进一步研究可能会促进并为OC的个体化治疗提供一些前景。对预后模型感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！
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