导语
今天给同学们分享一篇细胞焦亡结合诊断模型和表达验证的生信文章“Diagnostic and predictive values of pyroptosis-related genes in sepsis”，这篇文章于2023年2月2日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。
脓毒症是一种器官功能障碍综合征，由机体对感染的反应失调引起。然而，由于这种疾病过程的异质性，脓毒症的诊断和定义是临床工作中的一个关键问题。现有的脓毒症早期诊断方法特异性较低。
1. 微阵列数据集采集和数据处理
与脓毒症相关的微阵列数据集是从GEO数据库下载的。选择GSE26440作为内部训练和测试集，GSE13904作为外部测试集。GSE26440包含来自98个感染性休克样本和32个健康对照样本的130个全血RNA样本。GSE13904包括158个脓毒症样本和18个健康对照样本。GPL570-55999平台文件用于转换两个GEO数据集的基因符号。当多个探针映射到同一个基因符号时，选择探针的平均值作为基因表达值。此外，还选择了3837个DEG用于GSE26440数据集的差异表达分析。其中，2302个被下调（图1A），1535个被上调（图1A）。接下来，绘制了差异表达基因中前50个上调基因和前50个下调基因的热图（图1C）。
图1 内部训练集差异分析
此外，从以前的研究中收集了110个与细胞焦亡相关的基因。有35个DEGs和细胞焦亡相关基因的交集基因（图1B）。相交基因的PPI网络如图1所示。其中，节点颜色的深度和面积代表与基因的连接数。图1D、E显示了交集基因之间的Pearson相关系数(PCC)网络图。35个交集基因中的大多数具有很强的相关性。
此外，为了探索交集基因中涉及的通路信息，作者绘制了一个重要通路的气泡图，其中BP、CC和MF（图2）在GO富集分析和分别进行KEGG富集分析（图2）。
图2 GO、KEGG分析
2. 基因筛选与诊断模型构建
为了从35个交集基因中筛选出与诊断相关的基因，使用RF对35个特征的重要性进行排序。35个基因的平均权重为0.0285。作者保留了九个大于权重平均值的基因（图3A）。接下来，作者使用Adaboost、LR和DNN构建了脓毒症诊断模型，以识别与诊断相关的细胞焦亡相关基因。设置相应的分类器参数范围后，使用十折交集验证选择最优参数，然后得到内部测试集上的AUC结果（图3B）。使用前9个基因时，DNN的AUC达到0.9935。为了进一步确认特征基因的诊断能力，使用GSE13904数据集验证了结果（图3C）。DNN在使用前8个基因时可以达到0.9786的AUC。此外，使用DNN在内部测试集（图4A-H）和外部测试集（图5A-H）中进一步验证了八个基因。
图3 与诊断模型构建相关的条形图和折线图
图4 内部验证集前八个基因的单独验证结果
图5 在外部验证集上单独验证前八个基因的结果
3. 脓毒症中的免疫浸润
为探索脓毒症的免疫浸润，采用CIBERSORT算法分析显着脓毒症样本与健康对照样本外周血免疫细胞的差异。图6A-H中的箱线图显示了败血症患者和健康对照中八个诊断相关基因的表达。八个基因在两组之间存在显着差异。图7A显示了22种免疫细胞在对照样品和脓毒症样品中的比例表达。图7B显示了免疫细胞之间相关性的热图。静息肥大细胞和静息树突细胞具有最强的正相关性。相反，巨噬细胞M0和T细胞CD8具有最强的负相关性。图7C显示了脓毒症和对照之间不同免疫细胞标志物表达类型的差异表达。其中，B细胞naive、B细胞记忆、T细胞CD8、激活T细胞CD4记忆细胞、T细胞滤泡辅助细胞、调节性T细胞、T细胞γδ、激活NK细胞、巨噬细胞M0、巨噬细胞M1、静息树突状细胞、静息和细胞活化肥大细胞、中性粒细胞在两组间差异有统计学意义。此外，作者在图7D-K中展示了与22个免疫细胞相关的八个败血症诊断相关基因（CLEC5A、MALT1、NAIP、NLRC4、SERPINB1、SIRT1、STAT3和TLR2）的棒棒糖图。
图6 八种诊断相关基因在脓毒症患者和CLEC5A健康对照中的表达
图7 脓毒症和健康对照中的免疫浸润情况
接下来，作者分析了诊断基因与47个免疫检查点的关联。具体而言，免疫检查点与八个诊断相关基因保持显着关联，并创建了它们之间关联的热图（图8A-H）。对于CLEC5A，具有最强正/负相关性的免疫检查点分别是CD44和CD244。对于MALT1，具有最强正/负相关性的免疫检查点分别是BTLA和BTNL2。对于NAIP，具有最强正/负相关性的免疫检查点分别是CD44和TNFRSF25。对于NLRC4，具有最强正/负相关性的免疫检查点分别是LAIR1和TNFRSF25。对于SERPINB1，具有最强正/负相关性的免疫检查点分别是LAIR1和TNFRSF25。对于SIRT1，具有最强正/负相关性的免疫检查点分别是BTLA和ICOSLG。对于STAT3，具有最强正/负相关性的免疫检查点分别是C10orf54和CD276。对于TLR2，具有最强正/负相关性的免疫检查点分别是C10orf54和ICOSLG/TNFRSF25。
图8 八个基因与免疫检查点关联的热图
为了确定8个诊断相关基因与miRNA之间的调控关系，使用三个miRNA数据库查询诊断相关基因之间的调控关系。作者取了三个数据库结果的交集基因，绘制了诊断相关基因和miRNA的调控网络。更多的miRNA调节STAT3、NAIP和SIRT1。此外，作者应用DGIdb来鉴定可以逆转诊断相关基因表达的潜在药物或分子化合物。多种药物可能调节SIRT1、STAT3和TLR2。证明了一些化合物对脓毒症的抑制作用。HMGB1是一种存在于脓毒症晚期的细胞因子。丙酮酸乙酯(EP)对SIRT1的上调可能会促进HMGB1的去乙酰化，从而减少HMGB1从脂多糖(LPS)激活的巨噬细胞中的释放。此外，塞来昔布联合低剂量抗生素治疗小鼠脓毒症可显着降低小鼠不同器官的细菌负荷和炎症标志物。
4. 诊断相关基因的表达验证
qRT-PCR用于验证脓毒症组和对照组8个诊断相关基因的表达水平。结果显示，除STAT3外，其他基因的表达量在两组间差异显着（图9），与生物信息学分析结果一致。因此，进一步探讨它们在脓毒症中的作用对于脓毒症的诊断和治疗具有重要意义。
图9 诊断相关基因的表达验证
总结
作者以细胞焦亡相关基因为基础，利用机器学习方法探讨了诊断相关基因在脓毒症早期诊断中的潜在价值。此外，各种生物信息学分析方法被用于识别这些基因在免疫细胞和检查点中的差异。脓毒症的不同亚型在预后和生存方面可能存在显着差异。
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