导语
氧化应激（OS）是克罗恩病（CD）的重要病理生理机制。OS相关基因可能受到环境因素、肠道炎症、肠道微生物群和表观遗传学变化的影响。然而，OS作为CD潜在病因或触发因素的作用尚不清楚，因为CD中差异表达的OS基因可能是肠道炎症的原因或随后的变化。在此，作者使用了一种基于多组学的孟德尔随机化（SMR）方法来确定CD中OS基因的假定因果效应和潜在机制。
1. CD和HCC患者OS基因差异表达的Meta分析
为了了解OS基因在CD中的作用，共纳入了六个基因表达数据集（三个微阵列数据集和三个RNA-seq数据集），以比较CD患者肠道组织中的RNA表达（n = 704）和HC（n = 212）通过荟萃分析。总共817个OS相关基因具有相关性得分 ≥ 7从GeneCards下载。随后，438个OS基因在CD和对照组织之间差异表达（FDR < 0.05）（图1A）。按效应大小排序的前五个基因是DUOX2、MMP3、S100A8、MMP1和IL1B，它们都与IBD的肠道炎症有关。此外，作者对这些DEG进行了细胞类型特异性表达分析（CSEA）。OS相关的DEG在肠上皮细胞中显著富集（FDR = 0.002）（图1B），表明上皮细胞在调节肠道OS和维持粘膜稳态中的重要作用。
图1 CD和HCC患者肠道6个基因表达数据集的Meta分析
2. 来自血液的GWAS和OS相关eQTL/mQTL数据的整合
考虑到CD患者与HC患者相比观察到的OS DEG数量如此之多，作者假设基因表达可以解释该疾病中看似合理的因果关系。此外，位于启动子或增强子中的DNAm通常影响疾病相关靶基因的调节。因此，作者旨在鉴定CD的候选致病基因，并探索其在血液中基因调节的潜在表观遗传学机制。使用三步SMR方法，只有通过敏感性检查的所有三个SMR分析中的显著结果才被解释为提示性因果基因。
具体而言，eQTL的整合源于eQTLGen（n = 31684）和CD GWAS汇总统计结果产生了16个OS相关基因。同时，作者通过整合来自Brisbane Systems Genetics Study和Lothian Birth Cohorts（n = 1980）。对CD因果顺式eQTL和顺式mQTL数据的进一步整合分析优先考虑了八种可能调节五个相邻基因的DNAm探针：BAD、SHC1、STAT3、MUC1和GPX3。正如预期的那样，这些CpG位点在外周血细胞的转录起始位点（TSSs）中显著富集，包括原代造血干细胞和原代单核血细胞。
3. 血液甲基化调控CD致病基因表达
作者的三步SMR分析优先考虑STAT3，这是一种众所周知的氧化还原调节基因，其表达严格受细胞内氧化还原环境的影响。这项研究表明，在CD GWAS、eQTL和mQTL研究的数据中，与STAT3相关的SNP信号是显著的。发现脱氧核糖核酸探针cg06422947位于STAT3上游427kbp的增强子区。该位点的甲基化水平显示出对STAT3表达的负面影响（βSMR = − 0.11）和CD发作（βSMR = − 0.09），而STAT3表达水平与疾病呈正相关（βSMR = 0.70）。总之，作者的结果表明了一种假定的机制，其中STAT3增强子区较低的DNAm水平上调STAT3的表达，并随后增加CD风险（图2A，B）。
图2 使用血液组织的三步SMR分析优先考虑CD中假定的因果OS基因和机制
另一个关键的是GPX3（图3C，D），它属于谷胱甘肽过氧化物酶家族，催化谷胱甘肽还原有机氢过氧化物和过氧化氢，从而保护细胞免受氧化损伤。作者发现位于启动子区的脱氧核糖核酸探针cg08580836与GPX3的表达呈负相关（βSMR = − 0.24）。持续地，更高的GPX3基因表达（βSMR = − 0.15）和较低的甲基化水平（βSMR = 0.74）潜在地降低了CD的风险。因此，推测的机制可能是遗传变异通过影响启动子DNAm状态来上调GPX3的表达，显示出对CD发病的保护作用。
4. 来自肠道组织的GWAS和OS eQTL/mbQTL数据的整合
血液和肠组织对基因表达的遗传影响各不相同，这可能反映了不同的CD致病基因。此外，已知宿主遗传学和肠道微生物群在CD中发挥关键作用。肠道组织与肠道微生物直接接触，并感知OS水平的局部变化；因此，作者假设整合来自肠道组织的顺式eQTL和mbQTL将提供具有假定的宿主-微生物群相互作用的新的候选靶标。首先，对从 GTEx 项目 (n = 860) 获得的三种肠道组织的 cis-eQTL 数据进行了荟萃分析，调整了样本重叠。随后对来自1000IBD项目的肠道顺式eQTL数据进行了荟萃分析（n = 299）。最后的荟萃分析确定了43975个顺式SNP-基因对，对应于392个OS相关基因（FDR < 0.05）。SMR分析证明了五种肠道表达基因在CD中的潜在因果作用：MUC1、CD40、PARK7、PRKAB1和NDUFS1。
为了从宿主-微生物群相互作用的角度进一步探索肠道OS基因的作用，作者通过共定位分析将mbQTL汇总统计与假定的CD因果顺式eQTL整合。该分析被认为是为了确定粘膜基因表达的遗传决定因素与肠道微生物群共享的可能性。由于宿主基因对肠道微生物群的中度影响，导致功率问题，因此未使用SMR。在PPH4的阈值下总共检测到六对基因表达-微生物途径 > 0.5，包括上述基因中的三个，MUC1、CD40和PRKAB1。
5. CD致病基因参与肠道基因-微生物群相互作用
基于SMR和共定位分析，作者优先将MUC1作为与肠道微生物群相关的CD肠道组织中的候选OS致病基因（图3A）。作者的研究表明，MUC1表达的升高可能在CD发病中起着因果作用（βSMR = 0.57）。此外，根据共定位分析，调节MUC1表达的SNPs也可能影响微生物代谢功能。具体而言，肌酸酐降解和肌醇降解与炎症或短链脂肪酸产生减少相关的微生物群代谢途径与MUC1表达具有共同的遗传效应。作者的研究结果表明，MUC1的遗传变异可能同时调节其基因表达和微生物群衍生代谢产物的产生，从而增加CD的风险。
图3 SMR和共定位分析优先考虑CD中肠道致病OS基因和与肠道微生物途径的相互作用
CD的CD40基因是另一个参与肠道基因-微生物群相互作用的例子（图3B）。CD40及其配体（CD40L）与免疫细胞和内皮细胞中ROS的产生有关。它们构成巨噬细胞的第二个激活信号，并增强其激活和由此产生的潜在抗菌肽以及ROS、一氧化氮和相关代谢物。本研究显示CD40表达对CD的保护作用（βSMR = − 0.62），这也在其他免疫相关疾病研究的情况下发现。在遗传调控下，有三种微生物途径与CD40基因表达相关：从天冬氨酸生物合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，L-异亮氨酸生物合成，以及吡哆醛5′-磷酸生物合成和挽救的超通道。据报道，这些微生物群衍生物质也与肠道炎症有关。例如，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可以由某些肠道细菌从L-天冬氨酸中产生，这与IBD的肠道炎症有关。补充L-异亮氨酸可在体内和体外减轻肠道炎症。因此，作者假设了一种机制，通过该机制，遗传变异调节CD40的表达，并与炎症相关的微生物活动相互作用，从而促进CD的发病机制。
另一个候选致病基因是PRKAB1（图3C）。这项研究表明，PRKAB1的表达也与患CD的风险呈负相关（βSMR = − 0.30）。此外，其表达与微生物嘌呤核碱基降解具有共同的遗传效应，表明基因表达与肠道微生物核苷酸代谢之间的潜在相互作用。
6. 微生物群相互作用
为了证实上述优先基因，作者首先在一个独立的FAH-SYS队列中使用肠道转录组测序数据验证了荟萃分析的DEG结果。荟萃分析得出的438个肠道DEG中，总共有437个在CD和HC患者之间进行了测试。值得注意的是，388个（88.79%）基因在疾病条件下持续上调或下调（Spearman-rank r = 0.84；P = 2.2 × 10−23；图4A）。共有320个（73.23%）基因获得了P值 < 0.05，表明CD中OS基因表达发生了剧烈变化。
图4 外部队列验证
共定位分析证明了肠道基因表达和肠道微生物群的候选遗传调控；然而，关于后两者之间的相关方向的信息很少。然后，作者整合了来自FAH-SYS队列的配对粪便宏基因组和肠道基因表达数据。评估了可能参与共定位代谢途径的两个属和三个物种与肠道基因表达的相关性。在FAH-SYS队列中，5对基因-微生物群显示出显著相关性（P < 0.05）。与HCC相比，CD患者的肠道MUC1基因表达上调（β = 3.16；P = 6.76 × 10−15；图4B）。嗜酸芽孢杆菌是一种来自先前报道的参与肌醇降解的益生菌（PWY.7237），在CD组中的含量低于HC组（β = − 2.44；P = 0.0026）。在HC组中观察到MUC1表达与耐酸双歧杆菌丰度之间的负相关性（β = − 0.093；P = 0.05）。大肠杆菌是嘌呤利用者（P164.PWY）和与各种免疫相关疾病相关的机会性病原体。作者在CD中发现了更高丰度的大肠杆菌，而它与较低水平的PRKAB1基因表达（β = − 0.012；P = HCs为0.039；图4C）。同时，作者观察到FAH-SYS CD组中酿酒酵母丰度呈增加趋势（β = 0.38；P = 0.11），其参与L-异亮氨酸生物合成（PWY.5101）。酿酒酵母和CD40表达之间的关联也不显著（图4D）。值得注意的是，这些肠道基因表达与CD中的微生物群之间缺乏显著相关性，这可能是由于该疾病中的微生态失调，宿主-微生物群的相互作用被破坏。然而，来自外部队列的结果与eQTL–mbQTL共定位一致。这为MUC1表达的CD因果效应和PRKAB1表达在与肠道微生物群相互作用时的保护作用提供了补充证据。
总结
这项研究基于多组学MR方法扩展了对OS的潜在因果关系和CD潜在生物学机制的了解。作者证明，CD的发病可能是由许多候选OS基因通过DNAm、基因表达和与肠道微生物群的相互作用引起的。作者新发现的致病OS基因与微生物分类群和途径之间的宿主-微生物群相互作用值得在功能水平上进行研究，以更深入地了解潜在的生物学机制。这项研究推进了OS在CD中作用的基础研究，并为临床实践确定了潜在的新治疗靶点。
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