导语
今天给同学们分享一篇线粒体自噬+分型+小分子药物的生信文章“The landscape of mitophagy in sepsis reveals PHB1 as an NLRP3 inflammasome inhibitor”，这篇文章于2023年6月8日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.738。
线粒体自噬是一种选择性自噬，针对受损和潜在细胞毒性的线粒体，可以有效防止受损线粒体产生过多的细胞毒性产物，并缓解炎症反应。然而，线粒体自噬在脓毒症中的潜在作用尚未得到充分探索。
1. 脓毒症队列中线粒体自噬标志集的构建
为了测试脓毒症患者的线粒体自噬活性是否发生变化，作者首先评估了急诊室（ER）或重症监护室（ICU）样本中与线粒体自噬相关通路的富集情况（图1A）。作者发现，与健康人群相比，脓毒症患者的线粒体自噬活性普遍下调，尤其是ICU患者中的线粒体自噬正调控，表明线粒体自噬在脓毒症患者中可能起着重要作用。为了进一步探索线粒体自噬在脓毒症中的作用，作者通过WGCNA分析将脓毒症样本聚类为15个非灰色模块（图1B-D）。在分析不同模块之间的相关性、样本的临床特征和线粒体自噬通路得分之后，作者发现MEgreenyellow模块与多个线粒体自噬通路呈高度相关（图1C）。在进一步关注MEgreenyellow模块后，作者选择了与线粒体自噬通路高度相关的926个基因，与线粒体自噬相关的基因进行交集运算，最终获得了22个与脓毒症患者中线粒体自噬相关的核心基因（图1E，F）。这22个中心基因主要富集在多种线粒体生成相关模块中（线粒体膜、线粒体组织、线粒体基质、线粒体运输、中心碳代谢等）（图1G）。
图1 在脓毒症队列中确定线粒体自噬特征集
2. 根据线粒体自噬的特征集，在一组脓毒症患者中发现了三个线粒体自噬亚型
由于脓毒症患者的线粒体自噬程度普遍低于健康人群，作者接下来测试了脓毒症患者中与线粒体自噬相关基因的表达差异。作者进一步对获得的22个关键线粒体自噬相关基因在脓毒症样本中进行一致性聚类分析（图2A），发现不同脓毒症样本中的线粒体自噬基因可以稳定地聚类成3个亚型（图2B）。作者以线粒体自噬相关的中心基因富集分数作为评估不同样本中线粒体自噬活性的标准MA分数。显然，Cluster A中的中心基因富集非常丰富，而Cluster C中的MA分数明显下调，Cluster B则作为线粒体自噬变化的过渡亚型（图2C，D）。通过对不同临床特征的评估，作者发现ICU样本的线粒体自噬MA分数低于ER样本（图2E）。此外，MA分数随着SOFA（序贯器官功能衰竭评分）的增加而降低，SOFA评分用于评估临床实践中脓毒症的严重程度（10）（图2F）。然而，MA得分在存活和死亡患者之间无法比较（图2G）。此外，SOFA得分越高，Cluster C的百分比也越高。Cluster A与Cluster C呈反向关系（图2H）。同样，Cluster A主要富集在ER样本中，而Cluster C主要富集在ICU样本中（图2I）。通过评估线粒体自噬生物过程的富集情况，作者确认Cluster A具有最高的线粒体自噬活性，而Cluster C显示出最低的线粒体自噬活性（图2J）。
图2 严重感染队列中的线粒体自噬聚类
作者接下来测试A、B和C类群中哪些分子和级联反应诱导了线粒体自噬活性（36）。在与自噬相关的分子中，ATG5和ATG9B能够诱导自噬体的形成，而在泛素家族中的UBC也显著增加在A类群中（图2K）。在独立于泛素的线粒体自噬中，PRKN在A类群中显著上调，而AMFR和MUL1则在A类群和B类群中富集（图2L）。在受体介导的线粒体自噬中，多种相关分子（如BNIP3、FUNDC1等）在A类群中增加（图2M）。此外，线粒体动力学和应激诱导相关分子在不同类群中也发生了变化（图2N、O）。以上结果表明，线粒体自噬功能障碍可能导致不同程度的脓毒症病理状态，并且多个分子途径参与了脓毒症中的线粒体自噬。
3. 线粒体自噬亚型中的免疫景观差异
脓毒症的发病机制涉及复杂的全身炎症网络效应和免疫功能紊乱。因此，作者进一步探索了不同亚型之间的免疫特征差异。作者整合了多种免疫分析算法，并将所有免疫细胞分为四个来源：淋巴细胞、髓系细胞、干细胞和基质细胞（图3A）。淋巴细胞在A亚型中富集（图3A），但在C亚型中显著减少（图3B）。不同类型的髓系细胞分布在这3个亚型中。例如，M2巨噬细胞的丰度在A亚型中显著增加（图3C），这可能与抗炎反应的增强有关。基质细胞和共同淋巴祖细胞（CLP）的富集在亚型之间存在差异（图3D、E）。在整体免疫景观中（图3F），从A亚型到B亚型，再到C亚型，淋巴免疫细胞的丰度逐渐减少，而髓系免疫细胞的丰度增加，从而介导了炎症反应的加重。此外，与对照组相比，B亚型中不同免疫细胞比例的差异并没有明显改变。作者还关注了脓毒症不同亚型中免疫检查点表达的变化（图3G）。与正常样本相比，发现了一些免疫检查点相关基因的表达水平在C亚型中发生了许多变化，例如CD274和PDCD1LG2上调，而CTLA4和TIGIT下调，这可能与体内炎症效应增强和免疫功能障碍有关。线粒体自噬功能障碍在一定程度上反映了免疫特征的变化。
图3 线粒体自噬亚型的免疫景观
4. 作为与线粒体自噬相关的基因，PHB1在不同的亚型中表达差异明显
为了从线粒体自噬中心基因中识别出与亚型相关的核心靶点，作者将中心基因模块化并分为两个模块（图4A），其中核心模块主要与线粒体膜和线粒体包膜的生物过程相关（图4B）。在这些基因中，作者发现PHB1位于整个网络的核心位置，具有最高的度值。PHB1是与线粒体自噬相关的基因，在线粒体自噬中发挥重要作用。作者进一步研究了不同亚型和临床特征中PHB1表达的差异。亚型A的PHB1表达高于健康样本，而亚型C的表达低于正常样本（图4C，D）。此外，随着SOFA分级的增加，PHB1的表达降低（图4E）。与亚型A相比，亚型C显示出高表达的经典炎症小体相关通路，即Nod样受体信号通路（图4F）。作者还关注了其他与炎症相关的通路的表达情况，发现亚型C中的炎症反应高度上调（图4G）。炎症相关途径的变化通常伴随着多个炎症小体表达的变化。在三个聚类中，多个炎症小体分子在C聚类中上调表达（除了NLRP1）（图4H）。此外，核心线粒体自噬分子PHB1与多种炎症小体分子呈负相关，特别是与NLRP3、MEFV和NLRP12（图4I）。由于炎症小体具有多种分子调控途径，作者还探索了线粒体自噬聚类中不同炎症小体相关调控途径的分子表达，发现多个调控分子存在聚类差异（图4J）。以上结果进一步表明，线粒体自噬功能障碍与炎症效应高度相关。
图4 线粒体自噬中PHB1的鉴定
5. PHB1通过调节线粒体自噬抑制NLRP3炎症小体的激活
大量研究表明，NLRP3炎症小体的异常激活在脓毒症的发病和进展中起着重要作用。NLRP3炎症小体对病原相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）非常敏感，如ATP和线粒体DNA（mtDNA）。在感知PAMPs和/或DAMPs的过程中，NLRP3招募ASC和半胱天冬酶-1，导致半胱天冬酶-1的激活、成熟和分泌促炎细胞分子，如IL-1β和IL-18，从而引发火焰细胞死亡。NLRP3炎症小体被广泛认为是治疗脓毒症的理想药物靶点。
为了验证核心线粒体自噬分子PHB1对NLRP3炎症小体的调控作用，作者在分离的巨噬细胞中敲低了PHB1（图5A），并用两种经典的NLRP3炎症小体激动剂ATP和Nigericin刺激LPS预处理的细胞。作者发现，在敲低PHB1后，细胞释放的促炎因子IL-1β和IL-18显著增加（图5B）。同时，作者还发现，在敲低PHB1后，细胞质中的线粒体DNA（mtDNA）增加（图5C），表明可能抑制了线粒体自噬。当作者用自噬抑制剂3-MA处理细胞时，作者发现敲低PHB1组和对照组细胞释放的促炎因子IL-1β之间没有显著差异（图5D）。以上实验结果证明，PHB1通过调节线粒体自噬抑制了NLRP3炎症小体的激活，这与作者的数据分析结果高度一致。
图5 PHB1通过调节线粒体自噬抑制NLRP3炎症小体的激活
6. 小分子药物与PHB1结合的挖掘
以上分析结果表明，PHB1在脓毒症中发挥着重要作用。为了进一步筛选可能靶向PHB1发挥抗炎活性的小分子药物，作者测试了来自DrugBank数据库的9,468种药物与PHB1的亲和力（图6A）。首先，作者通过文献检索和结构预测确定了PHB1的蛋白质结构域（图6B、C）。由于PHB1不属于激酶蛋白，其活性不能直接由底物激活。因此，作者尝试筛选出能够通过结合其泛素化位点增加其蛋白质稳定性以进一步调节线粒体自噬的药物。进一步分析显示，泛素化位点主要集中在SPFH2、CC1和CC2序列中（图6B、C），因此作者将对接区域限制在这三个序列中。经过模拟对接，作者发现只有9,468种药物中的九种与PHB1结合的最佳构象具有≤-8的亲和力。进一步筛选显示，9种药物中有4种药物的构象与PHB1的泛素化位点结合亲和力≤-8，它们是Bemcentinib、Tirilazad、RU82209和Phthalocyanine（图6D、E、S1-5）。其中，Bemcentinib具有最多的预测结合位点（K202_-8.0 kcal/mol，K177_-7.7 kcal/mol，K128_-7.5 kcal/mol，K128_-7.2 kcal/mol）（图6F、G），而其他三种药物也对泛素化位点具有较高的亲和力，Tirilazad（K186_-8.0 kcal/mol，K128_-7.6 kcal/mol），RU82209（K177_-8.1 kcal/mol，K177_-7.0 kcal/mol）；Phthalocyanine（K186_-8.2 kcal/mol）。此外，预测显示Bemcentinib和Phthalocyanine分别能够与残基K128和K186发生氢键相互作用，而RU82209能够与残基K177发生π-阳离子相互作用。总之，作者已经确定了四种可能影响PHB1蛋白泛素化修饰并发挥抗炎活性的小分子药物（图7）。
图6 PHB1小分子药物的鉴定
图7 PHB1介导的线粒体自噬在感染性休克患者中的模式图
总结
作者最终找到了四种药物（Bemcentinib、Tirilazad、RU82209、Phthalocyanine），它们可能与PHB1蛋白的泛素化位点结合，增加蛋白的稳定性。其中，作者了解到Bemcentinib目前正在研究用于非小细胞肺癌的治疗，分析结果显示Bemcentinib能够与PHB1的多个泛素化位点（K202、K128、K177）具有较高的亲和力。有趣的是，Bemcentinib也是Spike糖蛋白的抑制剂，此药物此前已被报道用于COVID-19的治疗，这也表明Bemcentinib可能是一种具有潜在抗炎活性的小分子药物，可用于脓毒症的治疗。这些药物是否能有效作用于PHB1还需要进一步的实验验证。尽管如此，作者的工作仍为临床药物筛选和后续药物开发提供了线索和一定的参考价值。在后续的研究中，作者将通过相关实验进一步筛选具有抗炎活性的靶向PHB1的候选化合物。
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