为了研究小鼠变异抗体融合蛋白PD1-IL2v对胰腺癌生长的影响，我们利用了KRAS驱动的PDAC的正位移小鼠模型，使用了PK5L1940和FC1242 KPC细胞系。我们将PD1-IL2v与其主要成分进行了比较，包括放疗和不放疗。在这些条件下，PD1-IL2v在我们的肿瘤模型中表现出明显的改善生存的效果。有趣的是，加入放疗作为细胞毒性药物后，对PD1-IL2v的反应进一步改善。单独使用aPD-1治疗并没有额外的益处，与未治疗对照组表现相似，而联合放疗和aPD-1治疗与单独使用每种治疗相比，反应稍微恶化。此外，使用非靶向的IL-2变异体，我们再次发现非特异性IL-2激动并没有改善生存，而放疗+DP47-IL-2v与每种治疗单独使用相比，也没有改善生存。为了确保对PD1-IL2v治疗的观察到的反应是由同一细胞内发生的in cis相互作用引起的，我们还使用aPD-1 + DP47-IL-2v的组合治疗肿瘤携带的小鼠。在这个模型系统中，独立的PD-1阻断和IL-2激动剂治疗并没有改善生存率，这表明PD1-IL2v治疗后的改善反应是由于特异性地将变异IL-2传递给PD-1 CTLs。
接下来，我们试图确定参与对这些治疗方案的反应的免疫亚群。从单药疗法组与RT + PD1-IL2v联合治疗组开始，流式细胞术分析显示，PD1-IL2v，无论是否联合RT，都会导致显著的CD8 T细胞扩增和各个区域的Tregs减少。我们的结果表明，这些肿瘤在基线时具有II型适应性免疫耐药表型，其特征是PD-L1表达的肿瘤细胞和免疫浸润的存在，如Kim等人最近的一篇综述中所定义。通过对单药治疗和联合治疗实验中的肿瘤浸润免疫群体进行流式细胞术分析，我们观察到RT + PD1-IL2v治疗后肿瘤内CD8 T细胞群体显著扩增，而RT或RT + aCD25治疗中未观察到这种情况。 此外，尽管RT + aCD25治疗在降低肿瘤内Treg细胞频率和IL-10表达方面是组合放射免疫治疗中最有效的，但PD1-IL2v治疗无论是否结合RT，都导致肿瘤内CD8 T细胞与Treg细胞比例的最大增加。
为了评估RT和PD1-IL2v联合治疗对CTL功能的影响，我们接下来对肿瘤浸润的CD8 T细胞进行了viSNE聚类分析。通过这个分析，我们发现了一个增殖和功能性的CD8亚群，其特征是高表达Ki67、TNF-α和Granzyme-B，在加入PD1-IL2v后其数量增加，进一步强调了PD1-IL2v免疫细胞因子的CD8激活特性。我们还发现，一个多功能的CD8亚群，其特征是高表达Ki67、IL-2、IFNγ和TNF-α，在所有治疗组中与仅RT相比有所增加。与单一治疗相比，RT + PD1-IL2v导致肿瘤内IFNγ的CD8 T细胞比例最高，进一步解释了与PD1-IL2v单独相比，这种放射治疗联合的生存益处增强的原因。
鉴于观察到aCD25的同时给药并没有增加RT + PD1-IL2v的生存益处，并且基本上消除了RT + PD1-IL2v中CD8 T细胞/Treg比例的增加，我们比较了这些治疗组中的CD8 T细胞亚群。PD1-IL2v的给药增加了肿瘤内CD8 T细胞上CD25的表达，但当与aCD25治疗联合使用时，这些CD25 CD8 T细胞的比例显著降低。为了进一步研究CD25 CD8 T细胞对我们观察到的RT + PD1-IL2v治疗小鼠的抗肿瘤效应的功能贡献，我们进行了蛋白质组学研究。通过比较接受RT + PD1-IL2v治疗的肿瘤携带小鼠中的CD25和CD25 CD8 T细胞，我们观察到了更活跃和移动的表型特征，表现为增强的RNA处理和中间丝的细胞骨架重组，这在使T细胞组织迁移能力发生变化的刚度变化中起关键作用。
除了CD25的表达外，三联组合还似乎增加了疲劳（PD-1+ TIM3 + ）CD25 − CD8 + T细胞在肿瘤携带小鼠的肿瘤微环境中的频率，与接受RT + PD1-IL2v治疗的小鼠相比。此外，与RT + aCD25 + PD1-IL2v相比，接受RT + PD1-IL2v治疗的肿瘤中激活（GnzmB + ）和抗原经历过的、类似干细胞的CD8 + T细胞（PD-1 + TCF1/7 + ）的频率显著更高。
在介导RT + PD1-IL2v治疗的改善反应中，我们已经确定了CD8 T细胞在其中扮演的关键角色，因此我们希望了解我们的治疗方案对携带肿瘤的小鼠引流淋巴结中CD8 T细胞的启动和激活的影响。通过流式细胞术分析，我们发现PD1-IL2v治疗显著增加了淋巴结中CD8 T细胞的频率，与肿瘤中的情况相似。此外，RT + PD1-IL2v联合治疗显著增加了淋巴结中多功能的CD8 T细胞，甚至与单独使用PD1-IL2v治疗相比也有显著增加，并且显著减少了淋巴结中耗竭的CD8 T细胞。 值得注意的是，在RT + PD1-IL2v和PD1-IL2v治疗小鼠的引流淋巴结中，Treg数量显著减少，同时在这两种治疗中，淋巴结CD4 + T细胞中的FoxP3和IL-10表达也减少，这表明PD1-IL2v治疗小鼠的引流淋巴结中效应T细胞的抑制减弱。此外，PD1-IL2v治疗组和RT联合PD1-IL2v治疗组中CD4 + T细胞上IL-10的表达减少，可能表明Treg的脆弱性增加。
在这个系统中，我们观察到接受RT + PD1-IL2v治疗的小鼠中，肿瘤浸润的CD45.1 + CD8 + T细胞数量显著增加。我们还观察到，与未经处理和仅接受RT治疗的肿瘤携带小鼠相比，接受RT + PD1-IL2v治疗的小鼠的循环血液和引流淋巴结中OVA特异性CD8 + T细胞频率显著增加。与PD1-IL2v单独治疗相比，RT + PD1-IL2v联合治疗还显著增加了tdLN中OVA特异性CD8 + T细胞的数量，而血液水平相似。从功能角度来看，接受PD1-IL2v治疗的小鼠循环血液中的CD45.1 + CD8 + T细胞发现其激活标记物IFNγ、IL-2、GnzmB和CD218的表达增加。RT + PD1-IL2v治疗后，tdLN驻留的CD45.1 + CD8 + T细胞中也发现CD44、CXCR3、Ki67和TNF-α的表达增加。此外，RT + PD1-IL2v联合治疗还增加了循环和淋巴结多功能CD8 T细胞以及血液中活化的循环NK细胞。然而，淋巴结中经RT + PD1-IL2v处理的特异性OVA CD8细胞发现CD62L表达减少，表明其具有增加的迁移能力和效应记忆CD8 T细胞表型特征。此外，经PD1-IL2v治疗的肿瘤中的特异性OVA CD8 T细胞，无论是否经过RT处理，都表现出更高的激活标记物CD69、IL-2和IFNγ的表达，以及更低的耗竭标记物TIM3的表达。
为了验证肿瘤特异性CD8 T细胞功能增强的主张，我们直接检测了RT + PD1-IL2v治疗对体外抗原特异性CD8 T细胞的细胞毒作用。为此，我们从表达OVA的肿瘤携带小鼠中收集了经过RT或RT + PD1-IL2v处理的CD8 T细胞，并含有移植的OVA特异性CD45.1 OT-I T细胞。然后，我们将这些分离的CD8 T细胞与表达OVA的胰腺癌细胞在体外培养，并量化所产生的癌细胞死亡。
为了揭示RT + PD1-IL2v治疗后减少转移负担的潜在机制，我们接下来对循环免疫细胞群体进行了流式细胞术分析。与肿瘤和肿瘤引流淋巴结一样，经PD1-IL2v治疗的带瘤小鼠血液中的CD8 T细胞显著增加。此外，我们发现RT + PD1-IL2v组和PD1-IL2v组的循环CD8 T细胞更频繁地表达增殖标记物Ki67。降维分析显示，经RT + PD1-IL2v处理的外周CD8 T细胞也表达了功能和激活标记物TNF-α、IFNγ和CD44。
为了直接测试这种免疫调节对转移和疾病传播的影响，我们接下来使用了一个胰腺癌的半脾切除转移模型，其中肿瘤细胞通过脾血管注射，并在肝脏中形成可重复的转移病灶。在使用PK5L1940细胞系的这个模型中，我们发现将PD1-IL2v添加到治疗方案中可以减少在牺牲时肝脏中的明显转移病灶，并改善与未经处理、RT-和RT + aCD25处理的小鼠相比的生存率。此外，在RT + PD1-IL2v治疗组中，有1/8只小鼠出现完全反应，在RT + aCD25 + PD1-IL2v治疗组中有2/8只小鼠出现完全反应，突显了PD1-IL2v诱导的抗肿瘤免疫反应的强大和全身性质。在使用FC1242细胞系的这个模型中，也实现了这些治疗组合的完全反应。
在我们的转移性肿瘤模型中观察到完全的肿瘤根除后，我们接下来试图探索肿瘤排斥的免疫机制，并确定RT + PD1-IL2v联合治疗是否能诱导持久的记忆反应，同时还考虑了是否使用aCD25。
我们还在FC1242半脾模型治愈的小鼠中进行了侧腹肿瘤再挑战实验。在这个模型中，我们再次观察到肿瘤生长期后的肿瘤排斥期；然而，由于侧腹肿瘤溃疡，三联组合治疗组中的五只小鼠中有两只在肿瘤排斥之前被安乐死。有趣的是，对再挑战的FC1242侧腹肿瘤的抗肿瘤免疫反应显示出更高的调节性T细胞功能降低。与PK5L1940再挑战不同的是，再挑战后循环血液中CD8 T细胞的CD62L MFI增加，表明具有淋巴结归巢表型，但两次再挑战都导致CD8 T细胞激活趋势增高，表现为CD69表达。有趣的是，FC1242肿瘤再挑战还导致循环中活化NK细胞的频率增加。这些数据共同表明，RT + PD1-IL2v介导的效应T细胞激活不仅会产生最初的抗肿瘤免疫反应，还会建立持久的T细胞介导的记忆反应。
鉴于我们治疗方案对CTL扩增和激活的深远影响，我们随后对分选的CD8 T细胞和NK细胞进行了蛋白质组学分析，以确定RT单独或与aCD25、PDl-IL2v或两者的组合对细胞蛋白组的影响。有趣的是，无监督分析，包括主成分分析和基于方差分析对前1500个蛋白质进行的层次聚类分析，显示治疗方案对蛋白质表达的变化产生了更强的影响，而不是细胞类型，根据治疗方案，有1164个蛋白质表达差异显著，而根据细胞类型只有206个蛋白质表达差异显著（240个蛋白质在基因集中共享）。更具体地说，RT + PDl-IL2v和三联组合治疗，而不是RT + aCD25，对CD8 T细胞和NK细胞的细胞蛋白组产生了显著影响，并且两者表现出相似的表型。 通路分析发现PD1-IL2v对转录能力以及T细胞受体信号传导和代谢有显著影响。NF-κB被确定为差异表达蛋白互作网络中度最高的节点。同样，对PD1-IL2v的反应中，T细胞受体信号传导通路（KEGG：hsa04660）的几个成分被上调，包括CD8α、Akt1和2、CD247、CDC42和NFATC1。
值得注意的是，所有治疗方法都促进了循环蛋白酶解/纤维化标志物水平的降低。尤其值得注意的是，在RT + PD1-IL2v治疗后，游离脂肪酸的水平增加（尤其是饱和脂肪酸14:0和16:0；单不饱和脂肪酸16:1和18:1；多不饱和脂肪酸18:2、18:3和20:3；以及高度不饱和脂肪酸20:5）。这一发现尤为重要，因为最近已经显示脂肪酸代谢在CD8 T细胞增殖和功能，尤其是CD8记忆T细胞功能和激活中起到调节作用。所有治疗方法后，乳酸增加，丙酮酸减少，尤其是PD1-IL2v。鉴于稳态测量的限制，我们随后进行了体外示踪实验，使用U- 13 C 6 -葡萄糖来确定循环血清乳酸水平的增加是否至少部分与CD8 + T细胞中糖酵解通量的增加相关。乳酸是糖酵解的副产物，据报道可以增加CD8 + T细胞的干细胞特性，增强抗肿瘤免疫力。我们发现，在经过标记葡萄糖的6小时孵育后，PD1-IL2v引起的1,2,3- 13 C 3 -乳酸积累显著增加，尤其是在联合治疗RT + PD1-IL2v的动物中。这个结果与在接受RT + PD1-IL2v治疗的肿瘤中观察到的TCF1/7 + CD8 + T细胞频率的增加相一致。
为了进一步证明RT + PD1-IL2v治疗的临床实用性，我们接下来对对RT治疗的反应者和非反应者进行了基因集富集分析。通过对我们的数据在标志性基因集上的评估，我们发现在反应者中，许多最显著上调的通路与增强的免疫活性有关，包括炎症反应、IFNγ和IFNα信号传导以及IL-2/STAT5信号传导的富集。有趣的是，在反应者中，IL-2Rβ是最常出现在10个最显著上调通路中的基因之一，进一步支持将IL-2Rβ激动作为标准细胞毒性治疗方案的一部分。
最后，为了了解放射治疗对循环免疫细胞活化状态的系统影响，我们对作为I期放射剂量递增试验的一部分收集和分离的外周血单个核细胞进行了质谱细胞术飞行时间分析，分别在放疗前、放疗期间和放疗后进行。通过对活细胞CD45+ CD3 + 群体进行viSNE聚类分析，我们发现PD-1表达在CD8 + T细胞亚群中优先增加，并且在CD4 + 和FoxP3 + 群体中保持不变，这表明CD8 + T细胞的系统性耗竭可能导致胰腺癌治疗失败。由于免疫检查点抑制剂试验在胰腺癌中尚未取得成功，这些数据表明，尽管PD-1介导的免疫耗竭是对放射治疗获得性耐药的关键因素，但通过使用PD1-IL2v等药物维持细胞毒性免疫群体中的持续IL-2Rβ信号可能提供额外的益处，从而提高放射治疗的治疗效果。
至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：作者首先详细的介绍了胰腺导管腺癌患者对放射治疗的反应；第二部分描述了PD1-IL2v这种双特异性免疫细胞因子的特性和功能；第三部分探讨了其在肿瘤抗原特异性T细胞激活中的作用；第四部分叙述了基于PD1-IL2v的免疫治疗效果及其在未来治疗中的前景。全篇内容丰富，为我们提供了许多关于免疫治疗的新视角，对于从事免疫研究的小伙伴来说是一篇不可错过的好文章！
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