导语
今天给同学们分享一篇单基因+泛癌+甲基化+实验的生信文章“Integrated pan-cancer analysis and experimental verification of the roles of tropomyosin 4 in gastric cancer”，这篇文章于2023年3月13日发表在
Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。
全球范围内，胃癌在发病率上排名第五，在死亡率上排名第三。早期肿瘤可以通过内窥镜手术或根治性胃癌手术切除。然而，由于胃癌具有高度侵袭性，大多数被诊断出患有胃癌的患者表现出晚期胃癌进展，并且很可能正在接受氟尿嘧啶和铂类化疗治疗。分子靶向药物，如曲妥珠单抗（抗人表皮生长因子受体2，HER-2）和尼伐替尤单抗免疫疗法（抗程序性细胞死亡蛋白1，PD-1），逐渐改善了患者的预后，但并非所有情况都适用。因此，迫切需要确定新的预后生物标志物和分子靶点，以预测胃癌患者的预后并指导个体化治疗。
图1 流程图
1. TPM4表达水平及其亚细胞定位
HPA数据集显示TPM4在泌尿生殖系统、呼吸系统和消化系统中的表达排名靠前（图2A）。TCGA和GTEx数据集显示TPM4在BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、LAML、LGG、LIHC、LUCS、OV、PAAD、PCPG、PEAD、READ、SARC、STAD和TGCT中显著上调（P < 0.05）。相反，TPM4在BLCA、KICH、KIRP、LUAD、PRAD、LUSC、SKCM、THCA、THYM、UCEC和UCS中下调（P < 0.05）（图2B）。GEPIA2的数据集显示PAAD和SKCM与肿瘤分期显著相关（P < 0.05）。根据TCGA数据集分析的结果，TPM4在BLCA、BRAC、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、PRAD、STAD和UCEC的肿瘤组织和配对正常组织中表达差异显著（图2C）。观察到TPM4在肌动蛋白丝（图2D）和细胞质（图2E、F）中的亚细胞定位。因此，作者的结果表明TPM4在大多数肿瘤中上调，并且在STAD中高于配对（非配对）正常组织的表达水平。
图2 TPM4的表达水平和定位
2. TPM4表达与泛癌预后和诊断的相关性
根据森林图和Cox评估的结果（图3A），TPM4是ACC、CESC、CHOL、DLBC、ESCC、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、MESO、PAAD、STAD、UCEC和UVM的总体生存不良因素（P < 0.05，HR > 1），而在COAD、COADREAD、OS和PCPG中可能是有益因素（P < 0.05，HR < 1）。此外，作者重点关注TPM4表达与消化系统恶性肿瘤的关联，TPM4高表达与LIHC（图3D，p = 0.02）、ESCC（图3E，p = 0.028）、PAAD（图3F，p < 0.001）和STAD（图3G，p = 0.018）的不良预后显著相关。值得注意的是，在COAD（图3B，p = 0.04）和COADREAD（图3C，p = 0.009）的情况下，低TPM4表达的患者预后比高TPM4表达的患者更差。接下来，作者使用ROC曲线评估TPM4在消化系统癌症的诊断效能。TPM4在预测COAD（AUC = 0.807）（图3H）、COADREAD（AUC = 0.837）（图3I）、ESCA（AUC = 0.725）（图3J）、LICH（AUC = 0.739）（图3K）和STAD（AUC = 0.795）（图3L）方面具有一定的准确性。TPM4表达在预测PAAD（AUC = 0.972)（图3M）。总的来说，TPM4的表达在不同的癌症中，包括胃腺癌，在诊断和预后方面具有价值。
图3 TPM4表达与泛癌预后和诊断的相关性
3. 遗传改变分析
作者在cBioPortal上调查了TPM4在泛癌遗传变异。如图4A所示，TPM4表达在来自2565名不同癌症类型患者的131个样本中发生了变异，占样本的5%。TPM4的突变率在32种癌症类型中观察到，如图4B所示。最高的突变率（>60%）在卵巢癌症例中观察到。在包括胃癌在内的24种癌症中没有观察到较高的突变率。在胃癌中，最常见的变异类型是拷贝数变异（CNV）中的“突变”和“扩增”。随后，如图4C所示，作者调查了TPM4中推测的拷贝数变异（CNA）与泛癌组织中TPM4 mRNA表达的相关性。在胃癌中，鉴定出了15个突变基因，它们在TPM4高/低表达群体的突变谱中。前5个基因是ABCA12、DOCK3、NALCN、PCDH17和KRAS（图4D）。
图4 基因改变分析
4. 基因改变分析
作者评估了TPM4在正常组织和19种癌症组织中的启动子DNA甲基化水平。在BRCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、LUAD、PCPG、PRAD、THYM和UCEC中，TPM4的甲基化水平较高。相反，在GBM、KIRC、LICH、PAAD、SARC、STAD、TGCT和THCA中，它的甲基化水平较低（图5A）。随后，根据MethSurv数据库中TPM4的甲基化图谱，在STAD中确定了25个TPM4的CpG位点（图5B）。此外，mRNA修饰参数是表观遗传学的重要组成部分，参与了转录后基因调控。许多研究表明，mRNA修饰与癌症的进展和发生密切相关。m1A、m5C和m6A是常见的mRNA修饰类型。为了探索TPM4表达与45个mRNA修饰调节因子之间的相关性，选择了甲基转移酶（写入者）、去甲基酶（擦除者）和RNA结合蛋白（读取者）。如图6A-C所示，TPM4表达与大多数癌症组织中的m1A、m5C和m6A甲基化呈正相关。随后，在STAD中，前10个甲基化调控因子包括METTL14（m6A_writer; r=0.403, P < 0.0001）、YTHDF3（m1A_reader; r=0.421, P < 0.0001）、FTO（m6A_eraser; r=0.399）、TET2（m5C_eraser; r=0.375）、NSUN3（m5C_writer; r=0.374）、WTAP（m6A_writer; r= 0.368）、YTHDC2（m6A_reader; r=0.366）、CBLL1（m6A_reader; r=0.357）、FMR1（m6A_reader; r= 0.338）和YTHDC1（m1A_reader; r= 0.306）。以上结果表明，TPM4的表达与DNA甲基化和mRNA修饰在不同癌症中密切相关，包括STAD。
图5 TPM4的DNA甲基化分析
图6 TPM4表达与mRNA修饰甲基化调控因子之间的相关分析
5. TPM4表达与免疫浸润
作者调查了TPM4表达与肿瘤微环境（TME）中免疫细胞浸润之间的关联。EPIC在线工具显示，八种与TPM4表达在不同癌症中相关的免疫细胞，尤其是在KIPR、LUAD、PCPG、PRAG、STAD和UVM中（图7A）。ESTIMATE评分对于确定肿瘤纯度和TME中的免疫细胞浸润非常有用。作者的研究结果显示，TPM4表达与STAD中的ESTIMATE评分呈正相关（图7B）。接下来，作者评估了TPM4高表达组和低表达组在STAD中CD8 T+细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞和Treg细胞中的富集分数。两组之间的富集分数显示出显著差异（图7C）。免疫检查点（ICP）基因被发现在免疫细胞浸润和免疫治疗结果中起到了作用。作者的结果表明，TPM4的表达与BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、KICH、LGG、LIHC、LUAD、PAAD、PRAD、READ、STAD、THCA和UVM中这八个ICP基因（CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1、LG2和TIGIT）的表达呈正相关（图7D）。这表明TPM4通过不同的信号通路协调ICP基因的活动，并可能成为免疫治疗的关键靶点。TMB、MSI和NEO被认为是肿瘤免疫治疗反应的预测因子。此外，作者观察到TPM4的表达增加，并导致ACC、UCSC、GBM、PAAD和STAD中TMB的增加（图7E）。MSI与TGCT、SARC、ACC、UVM和STAD中的TPM4表达呈正相关（图7F）。TPM4的表达与ACC、TGTC、DLBC、PCPG和THCA中的NEO呈正相关（图7G）。总体而言，TPM4可能通过与免疫浸润细胞、ICPS、MSI、TMB和NEO在泛癌组织中的关联来影响抗肿瘤免疫。
图7 TPM4表达与免疫浸润的相关性分析
6. 在胃癌中构建lncRNAs-miRNA-TPM4网络
RNA22、DIANA-micro、miRWalk、miRcode和TargetScan被用于在STAD中识别TPM4的靶向miRNA，如图8A所示。作者分别从这些来源中鉴定出了7、24、2063、10和1230个TPM4的靶向miRNA。在三个数据库中预测出了41个共同的miRNA。为了进一步探索这41个miRNA的靶向lncRNA，作者使用了Starbase2.0，并发现了七个miRNA（hsa-miR-613、hsa-miR-338-3P、hsa-miR-206、hsa-miR-30e-5P、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-299-3p）具有靶向lncRNA的能力。mRNA表达通常与miRNA表达呈负相关。TPM4表达与hsa-miR-30e-5P（图8B）、hsa-miR-30b-5P（图8C）、hsa-miR-338-3（图8D）和hsa-miR-206表达（图8E）呈负相关。lncRNA可以作为竞争性内源性miRNA进一步调控mRNA表达。作者还确定了四个负调控的靶向miRNA及其靶向lncRNA（图8F）。最后，作者构建了一个GC的lncRNA-miRNA-TPM4调控网络（图8G）。
图8 在STAD中构建与TPM4相关的关键ceRNA网络
7. TPM4相关药物的敏感性分析
CTPR数据集显示了TPM家族成员（TPM1、TPM2、TPM3、TPM4）mRNA表达水平与药物敏感性之间的相关性；与TPM4表达呈正相关的前三种药物分别是COL-3（环素类似物）、CR-1-31-B（eIF4A抑制剂）和GSK525762A（Bet抑制剂）；（图9A；P < 0.0001）。根据GDSC药物敏感性结果，与TPM4表达呈正相关的前三种药物分别是5-氟尿嘧啶、AR-429（组蛋白去乙酰化酶抑制剂）和AT-7519（细胞周期依赖性激酶抑制剂），与TPM4表达呈负相关的药物分别是17-AAG（热休克蛋白90抑制剂）、博莱霉素（50 uM）、CHIR-99021（GSK-3α/β抑制剂）、多西他赛（图9C；P < 0.0001）。由于CTRP和GDSC药物敏感性预测结果中涉及的一些药物被用于科学研究，根据药物库的数据，FDA批准了基于TPM4相关数据的23种抗肿瘤药物（图9B）。作者使用CMap "qury"在线工具分析了TPM4高表达和低表达的差异表达基因（DEGs）。根据CMap数据库查询的结果，确定了包括ALK/BCR-ABL/BTK/CDK/Met抑制剂等在内的15种小分子药物，获得了8种针对TPM4的小分子药物，意味着它们具有治疗前列腺腺瘤的潜力。UVM、LUAD、KIRC、COAD、BRCA、HCC。值得注意的是，Rucaparib的绝对值得分最高，意味着该药物有治疗7种癌症的潜力（图9E）。Rucaparib是一种聚(ADP-核糖)聚合酶（PARP）抑制剂，用于治疗复发性卵巢和前列腺癌。
图9 TPM4相关药物在泛癌组织中的药物敏感性
8. 相对共表达的基因，以及对TPM4在STAD中的功能分析
作者从TCGA中确定了表达共同性的基因。热图显示了与STAD中TPM4表达呈正相关和负相关的前50个共表达基因（图10A、B）。与TPM4表达呈正相关的前100个共表达基因显示在PPI网络中（图10C）。前10个中心基因是COL1A2、COL1A1、CLO3A1、COL5A、POSTN、FN1、MMP2、LUM、SPARC和DCN（图10D）。前5个中心基因是COL1A2、CLO3A1、FN1、MMP2、LUM、SPARC和DCN（图10E）。随后，作者使用前300个共表达基因进行了GO和KEGG富集分析。GO分析涉及分子功能、细胞组分和生物过程（见图10F）。KEGG通路富集分析（见图10G）。结果显示，TPM4表达通过调节细胞外基质在胃癌中发挥作用。
图10 相关基因显示共表达，并对STAD中TPM4表达进行功能分析
9. TPM4敲低抑制细胞迁移和肿瘤侵袭
为了验证TPM4在胃癌中的功能，作者在实验室中使用了两种类型的胃癌细胞。数据显示了TPM4的mRNA（图11A）和蛋白表达水平（图11B）。在作者之前的研究中，经过shRNA慢病毒感染后，shTPM4的沉默效率为71.1%，TPM4的沉默抑制了胃癌细胞的增殖。在这项研究中，作者使用划痕愈合和Transwell实验来确定胃癌细胞的迁移潜力。TPM4的沉默抑制了AGS（图11C，P < 0.01）和BGC-823（图11D，P < 0.01）的迁移，这在划痕愈合实验中观察到。作者还发现TPM4的表达抑制了AGS细胞（图11E，P < 0.01）和BGC-823细胞（图11F，P < 0.01）的迁移。Matrigel Transwell实验显示，在TPM4沉默的情况下，AGS细胞（图11G，P < 0.01）和BGC-823细胞（图11H，< 0.01）的侵袭潜力显著降低。这些实验的结果表明，TPM4是一个促进胃癌肿瘤侵袭和细胞迁移的关键癌基因。
图11 TPM4的敲低抑制了细胞的迁移和侵袭能力
总结
TPM4在癌症中，包括胃癌，作为一个有前景的预后和诊断和免疫治疗的生物标志物。此外，TPM4表达与多西他赛和5-氟尿嘧啶敏感性相关。lncRNA-miRNA-TPM4网络调节胃癌进展的机制。TPM4作为一个癌基因和促进胃癌细胞侵袭和迁移的调节因子，可能通过细胞外基质重塑，需要进一步研究。
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