导语
今天给同学们分享一篇非肿瘤+WGCNA+机器学习的生信文章“Identification of biomarkers for the diagnosis of chronic kidney disease (CKD) with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) by bioinformatics analysis and machine learning”，这篇文章于2023年2月27日发表在Front Endocrinol (Lausanne)期刊上，影响因子为5.2。
慢性肾脏疾病（CKD）被定义为肾脏结构或功能异常，持续≥3个月，原因可以是多种。流行病学研究显示，亚洲约有4.343亿人患有CKD，其中大部分来自中国和印度等发展中国家。有效控制慢性肾脏疾病是全球面临的一项巨大公共卫生挑战。
图1 本文主要研究思路的路线图
1. 通过WGCNA鉴定了NAFLD样本中的关键模块基因
GSE89632是用于研究非酒精性脂肪肝（NAFLD）的代表性数据集，作者使用它来获取与NAFLD最相关的模块化基因（23-25）。首先，作者使用WGCNA方法来识别与NAFLD最相关的模块化基因。基于尺度独立性和平均连接性，作者选择β=26（尺度无关R^2=0.85）作为“软”阈值（图2A）。然后，作者选择不同的颜色来表示9个基因共表达模块（GCMs），如图2B所示。NAFLD样本与GCMs之间的相关性显示在图2C中，而被认为是关键模块的深青色模块（412个基因）与NAFLD样本之间的相关性最高（相关系数=-0.85，p=5.3e-19）。此外，在深青色模块中，模块成员与基因重要性之间存在显著正相关（r=0.68，p=4.2e-57），如图2D所示。
图2 通过在NAFLD数据集GSE89632中使用WGCNA鉴定模块基因
2. CKD与NAFLD之间相关的共享基因的鉴定
接下来，在GSE104954数据集中找到了386个差异表达基因（DEGs），其中227个上调，159个下调。图3A展示了这些差异表达基因的火山图。图3B展示了数据集中前50个最显著的差异表达基因的热图。然后，将386个DEGs和412个模块基因进行交集运算，最终得到了45个与非酒精性脂肪肝相关的共享基因，如图3C的维恩图所示。
图3 不同表达基因（DEGs）和与非酒精性脂肪肝（NAFLD）相关的共享基因的筛选
3. 对45个与非酒精性脂肪肝相关的交集基因进行富集分析
为了探索NAFLD相关共享基因在CKD发展中的生物功能和途径，对45个共享基因进行了GO和KEGG富集分析。共获得了563个与生物过程相关的显著结果和23个KEGG信号通路。对共享基因进行了GO分析以揭示其生物功能（图4A-C）。正如作者所见，在GO类别中，大多数共享基因主要涉及“程序性细胞死亡”、“炎症反应”、“代谢过程的正调控”和“免疫系统过程”（BP）；“细胞外基质”、“含胶原的细胞外基质”（CC）；“DNA结合转录激活因子活性，RNA聚合酶II特异性”、“DNA结合转录因子活性”等（MF）。KEGG通路富集结果显示，最常涉及的通路是IL-17信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、凋亡、Toll样受体信号通路等，这些通路与免疫反应和炎症密切相关（图4D）。
图4 45个NAFLD共享基因的GO和KEGG分析中的丰富项
4. 通过Cytoscape软件和机器学习鉴定与NAFLD相关的关键基因，并验证其差异表达
为了揭示每个蛋白质的相互作用，根据STRING数据库构建了共享基因的蛋白质相互作用网络（PPI网络）。图5A中有38条边和45个节点，随后使用Cytoscape软件进行分析。MCODE插件用于发现PPI网络中的重要模块，结果显示图5B中的两个簇中有8个关键基因紧密相连，作为重要模块。另一方面，根据随机森林算法确定了7个MeanDecreaseGini> 1.5的关键基因，如图5C所示。图5D中的Venn图显示了4个关键基因（DUSP1、FOSB、NR4A1、ZFP36）的交集，它们被用作与非酒精性脂肪肝相关的关键基因。此外，在另外两个慢性肾脏病数据集（GSE32591、GSE66494）中，这4个与非酒精性脂肪肝相关的基因明显下调（图6A、B），这与GSE104954的变化一致。
图5 通过Cytoscape软件和机器学习的交集来识别与NAFLD相关的关键基因
图6 通过两个CKD数据集验证了4个与NAFLD相关的关键基因的下调
5. 用ROC曲线评估CKD和NAFLD的诊断效能
在训练集GSE104954中，4个与NAFLD相关的基因（DUSP1、FOSB、NR4A1、ZFP36）的ROC曲线分别具有0.961、0.954、0.866和0.960的AUC值（图7A）。同时，在验证集GSE32591中，这些关键基因的AUC值分别为0.828、0.796、0.927和0.689，无法区分样本的来源是肾小球还是肾小管间质（图7B）。同时，在另一个验证集GSE66494中，这些关键基因的AUC值分别为0.958、1.000、0.889和0.932（图7C）。综合分析验证集和训练集的结果表明，这4个与NAFLD相关的基因可以作为慢性肾脏疾病的有效诊断标志物。
图7 通过ROC曲线在CKD和NAFLD数据集中验证了4个与NAFLD相关的关键基因的诊断效能
GSE104948和GSE104954作为姊妹数据集，分别代表了同一组样本的肾小球和肾小管间质转录水平信息。在GSE104948数据集中，4个与NAFLD相关的关键基因对CKD具有相同的良好诊断效果。同样，在数据集GSE32591中，对肾小管间质和肾小球样本进行了采样，并进一步探索发现这4个诊断标志物在不同解剖结构中显示出良好的效果。需要注意的是，这4个CKD诊断标志物在GSE89632数据集中对NAFLD也具有良好的诊断价值，其ROC曲线的AUC分别为0.951、0.968、0.974和0.915（图7D）。这一发现可能表明这四个基因在患有NAFLD的CKD患者的发展中起着重要作用。
6. 免疫浸润分析和相关性分析
根据富集分析的结果，与NAFLD相关的共享基因可能参与了CKD进展的免疫相关机制。因此，进一步探索4个诊断标志基因与CKD中免疫细胞浸润之间的相关性是值得关注的。首先，使用CIBERSORTx评估GSE104954数据集中22种免疫细胞的比例（图8A）。在CKD样本中，记忆B细胞、M1巨噬细胞、静息肥大细胞和γδT细胞的水平显著上调；然而，幼稚B细胞、调节性T细胞和活化肥大细胞的水平显著下调。接下来，探索了四个诊断标志基因与CKD免疫细胞的相关性（图8B）。FOSB表达与幼稚B细胞、调节性T细胞和活化肥大细胞的比例呈正相关，与静息肥大细胞、γδT细胞、M0巨噬细胞和M1巨噬细胞的比例呈负相关。ZFP36和DUSP1与调节性T细胞和静息NK细胞的比例呈负相关。NR4A1与B细胞初生、静止树突状细胞和激活肥大细胞的比率呈正相关，与静止肥大细胞、M1巨噬细胞和B细胞记忆呈负相关。在探索四个诊断标志基因表达之间的相互关系时，有趣的是它们彼此之间都呈正相关（图8C），这表明它们可能参与了一种共同机制来促进CKD的发展。此外，还探讨了免疫细胞的相互作用（图8D）。调节性T细胞和激活肥大细胞之间具有最强的正相关性（r = 0.53）。相反，静止肥大细胞与激活肥大细胞之间呈最强的负相关性（r = -0.83）。
图8 CKD样本的免疫景观和GSE104954的相关分析
与对照组相比，CKD样本显示出明显的免疫细胞浸润变化，并且四个诊断标志基因的表达与免疫细胞浸润显著相关。
总结
在这项研究中，4个与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关的基因（DUSP1、NR4A1、FOSB、ZFP36）被确定为慢性肾脏病（CKD）患者的诊断标志物，并且NAFLD可能通过免疫和炎症途径加速CKD的发展。还阐明了CKD中免疫细胞浸润的变化以及与诊断标志物的显著相关性。作者的研究可能为患有NAFLD的CKD患者提供诊断标志物和治疗靶点。
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