导语
今天给同学们分享一篇泛素化+预后+实验的生信文章“Identification and validation of a novel ubiquitination-related gene UBE2T in Ewing’s sarcoma”，这篇文章于2023年2月16日发表在Front Oncol期刊上，影响因子为5.738。
Ewing's sarcoma（ES）是全球最常见的恶性骨肿瘤之一。然而，ES的基因和信号通路的分子机制仍未被充分理解。为了确定与ES发展和进展相关的候选基因，本研究使用生物信息学方法筛选了与ES相关的关键基因和生物通路。
图1 本研究的流程图
1. 鉴定ES中的差异表达基因
在标准化了微阵列结果之后，发现了差异表达基因（GSE45544中的595个和GSE17618中的3343个）。根据维恩图，这两个数据集的重叠部分包括了187个基因（图2A）。在Ewing肉瘤组织和非癌组织的比较中，有56个下调基因和131个上调基因。
图2 DEG Venn图
2. 使用GO和KEGG进行DEG富集分析
DAVID被执行以完成功能和通路丰富性研究，以确定DEGs的生物分类。结果使用R语言包4.1.3版本进行可视化。根据KEGG通路的分析（图2B），DEGs在细胞周期和金黄色葡萄球菌感染方面得到了显著丰富。根据GO分析，DEGs中的BP（生物过程）变化主要丰富在细胞分裂、细胞增殖、细胞黏附、有丝分裂核分裂、正调节的凋亡过程和药物反应方面（图2C）。ATP结合、蛋白结合、染色质结合和蛋白激酶结合在DEGs的分子功能（MFs）中得到了显著丰富（图2D）。DEGs的CC（细胞组分）变化主要丰富在纺锤极、细胞膜、细胞质、焦点粘附、细胞溶质、核质、细胞外囊泡和细胞核中（图2E）。
3. 构建和分析蛋白质相互作用网络和模块
然后，执行了一个名为MCODE的Cytoscape插件工具，以建立DEG PPI网络中最有意义的模块。PPI网络（图3A）包括149个节点和1246条边，其中有36个基因下调和113个基因上调，而MCODE网络（图3B）由43个节点和857条边组成。此外，通过Cytoscape ClueGO可视化了MCODE-DEGs的生物过程分析（图3C），主要集中在调节细胞周期蛋白、丝氨酸/苏氨酸激酶活性、细胞分裂、核染色体分离、有丝分裂中期/后期转变的调节以及纺锤体组织等方面。此外，层次聚类发现最重要模块的基因表达水平在表达谱的训练集中明显区分了ES样本和非肿瘤样本（图3D）。
图3 构建PPI网络和MCODE模块
4. 关键差异基因的选择和评估
前15个关键基因包括CCNB2、CCT2、CD44、ECT2、FOXM1、HLA-DPA1、ITGA6、KIF20A、LYZ、MKI67、PLK1、RFC4、TGFBR2、TYMS和UBE2T，这些基因的程度水平在cytoHubba Cytoscape插件中被定义，并构建了一个中心基因的相互作用网络，结果为15个节点和43个边缘（图4A）。同时，表2列出了这些中心基因的名称、描述和作用。然后，使用Cytoscape ClueGO软件研究了中心基因的生物过程，主要集中在有丝分裂细胞质分裂、dTMP生物过程和自身抗原耐受诱导的正向调节上；这些数据表明中心基因在调节细胞周期和内部环境中的稳态方面具有重要功能（图4B）。此外，使用Kaplan-Meier方法在cBioPortal在线完成了中心基因的突变生存分析。在15个中心基因中，只有UBE2T的生存分析在经过对数秩检验后表现出统计学意义（P <0.05) UBE2T的改变显示出明显较低的总体和无病生存率（图4C），并且预后较差。这些数据表明UBE2T可能是ES进展中的重要生物标志物。因此，UBE2T被定义为“核心差异表达基因”，将在后续研究中进行探讨。
图4 核心基因的连接网络和生物过程研究
5. 在验证数据集中，UBE2T和CD99的表达变化以及ES样本的免疫组化（IHC）结果
核心差异表达基因（core-DEG）的表达经过GSE68776验证。火山图显示发现了15,440个差异表达基因（上调=939个，下调=6,435个；|log2FC|≥1.5；调整后P<0.05）。在验证数据集中，UBE2T显著上调（图4D）。此外，使用免疫组化（IHC）来确定Ewing肉瘤和正常组织中UBE2T蛋白的表达情况。研究结果显示，UBE2T蛋白在Ewing肉瘤中过度表达，而在正常组织中没有（图4E）。两组之间存在显著差异（P<0.01）（图4F）。显然，研究数据支持了作者的预测。此外，CD99在免疫组化中对Ewing肉瘤组织具有高度特异性的诊断价值，因此有必要观察Ewing肉瘤样本与对照组之间的差异。免疫组化结果显示CD99在Ewing肉瘤组织的细胞膜上呈弥漫阳性（图4G，H）。
6. UBE2T在ES训练集和验证集中的诊断性能
图5展示了UBE2T在ES中的诊断价值。与对照组相比，训练集（GES 17618和GSE 45544）中ES中UBE2T的表达显著增加（P<0.001，图5A）。UBE2T在诊断ES的ROC曲线下面积（AUC）为0.75，敏感性和特异性分别为0.85和0.62（图5B、C）。有趣的是，核心基因在验证集（GSE68776）中也在ES的诊断评估中表现出色。UBE2T的表达在ES中显著增加（P<0.0001，图5D）。ROC曲线下面积（AUC）为0.90，敏感性为0.94，特异性为0.79（图5E、F）。显然，这些发现表明UBE2T在ES诊断中具有出色的价值。
图5 核心基因诊断ES在训练集和验证集中的表现
7. ES中MCODE-DEGs亚组的分析
根据MCODE模块基因的表达水平，将55个ES患者的样本（在排除不符合纳入标准的样本后）分为4个亚组：C1（N=17）、C3（N=12）、C4（N=13）和C2（N=13）（图6A）。在k = 2到k = 10个聚类中，K = 2具有最高的一致性，k = 4排在第二位（图6B和补充图1）。UMAP分析显示聚类之间存在显著差异（图6C）。此外，热图显示MCODE-DEGs的表达模式在四个亚组之间存在差异（图6D）。此外，Kaplan-Meier生存分析显示亚组之间存在显著差异（图6E），尤其是C3和C4，C3患者的疾病发展速度比C4患者更快。此外，与C4相比，C3中有34个基因的表达水平显著升高（UBE2T、PBK、CKAP2、CKS1B、WDHD1、CHEK1、CKS2、CCNB2、NCAPG、CENPF、SMC4、SMC2、BUB1、ECT2、MCM7、FANCI、ANLN、DTL、EXO1、CDC6、FBXO5、TYMS、FOXM1、MKI67、CCNB1、TPX2、ATAD2、PCLAF、NUSAP1、KIF23、TICRR、BUB1B、TOP2A和ASPM）（图6F）。
图6 基于MCODE-DEGs表达谱的聚类分析识别ES患者的预后
8. UBE2T高表达与ES患者预后不良的相关性分析
基于训练集，进行了单变量Cox回归分析，以研究ES中核心DEG的预后风险，结果表明UBE2T是独立的风险因素（P <0.05，风险比= 1.52，95％ CI）（图7A）。此外，Kaplan Meier生存曲线显示UBE2T表达与生存之间存在联系。高UBE2T表达的患者总体生存时间明显短于低UBE2T表达（P <0.0001）（图7B）。此外，雨云图显示C3中的UBE2T明显高于C4（P <0.001）（图7C），且生存时间明显短于C4（P <0.005）（图7D）。这些结果表明，UBE2T表达的上调与ES患者不良预后有关。此外，风险评分和生存时间的研究表明，高风险评分组的患者生存时间明显低于低风险组（P <0.0001）（图7E）。这些发现表明高风险评分组导致疾病快速进展。图7F（包括上、中、下三部分）描述了各种风险评分、生存事件和基因表达变化之间的关联。可以看出，当UBE2T表达上调（图7F下部）且风险评分增加（图7F上部）时，患者的生存率显著下降（图7F中部）。正如预测的那样，UBE2T被视为一个独立的风险因素，其表达增加时风险评分也会增加。
图7 训练队列中UBE2T表达与ES患者预后的相关性分析
总结
总结一下，目前的研究发现UBE2T在ES患者的肿瘤组织中的表达量较非肿瘤组织要高，并且UBE2T在ES的诊断中具有重要价值作为生物标志物。此外，增加的UBE2T表达与糟糕的预后有关。因此，UBE2T可以作为ES患者独立的预后生物标志物。然而，现有的研究存在一些缺点。首先，需要考虑患者样本量的限制。因此，应将UBE2T研究纳入更广泛的ES队列中。其次，本研究仅研究了肿瘤组织中UBE2T的表达水平，并未研究UBE2T在体内或体外的功能。因此，需要进一步的测试和研究来揭示UBE2T在ES中的潜在机制。
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