为了寻找在肿瘤组织中克隆扩增的调节性T细胞特异表达的分子，而不是肿瘤浸润的传统T细胞或其他组织中的自然Tregs，作者首先在同基因BALB/c小鼠移植的CT26结肠癌中单细胞水平上检查了TCR库和CD3 T细胞的基因表达谱。通过单细胞RNA测序（RNA-seq）结合UMAP降维和Leiden分组，通过Treg相关基因的表达来定义Tregs，将其分为两个群体，即扩增和非扩增，根据TCR克隆型的大小（即一个群体中超过两个Tregs共同表达特定的TCR克隆型，另一个群体中每个Treg都表达一个非复制的唯一TCR）。比较这两个Treg群体的基因表达谱，发现27个基因在克隆扩增的Tregs中上调表达。在这27个基因中，进一步比较了小鼠肿瘤浸润性调节性T细胞（Tregs）与脾脏Tregs之间的差异，以及人类肿瘤浸润性Tregs与外周血液效应性Tregs之间的差异，发现只有一个基因CCR8，它在小鼠多克隆肿瘤Tregs和人类肿瘤Tregs中普遍表达，但在小鼠或人类肿瘤效应性T细胞（Tconvs）中不表达。与CCR8 – 肿瘤Tregs相比，CCR8 + 肿瘤Tregs在TCRα和TCRβ链中确实显示出高度偏倚和扩增的V-J使用，证实它们在肿瘤组织中的克隆扩张。
例如，在每个分数中占比超过1%的主要Treg克隆在CCR8 + 肿瘤Treg分数中的百分比要高于CCR8 – Treg分数（TCRα为28.2% vs. 3.7%，TCRβ为33.4% vs. 1.5%）。通过流式细胞术评估的蛋白水平上，约60%的Foxp3 + 细胞，尤其是Foxp3 high 细胞，在CT26肿瘤中表达CCR8，而在肿瘤引流和远端淋巴结中分别仅约15%和约10%，而只有少数的Foxp3 – CD4 + Tconvs在肿瘤组织和淋巴结中表达该分子。像CCR8 + 肿瘤Tregs一样，CCR8 + Tregs在淋巴结中，尤其是引流淋巴结（DLNs）中显示出克隆扩张。在肿瘤浸润的Foxp3 + 细胞中，CCR8 + 细胞的比例因肿瘤而异：例如，在CT26结肠癌和EMT6乳腺癌中约为60％，在Renca肾癌中约为30％。
作者接下来通过单细胞和批量RNA测序检查了人类肿瘤浸润T细胞中CCR8的表达情况。将浸润到肾癌（透明细胞癌）组织中的CD3 T细胞与健康供体外周血中的T细胞进行比较，发现肿瘤Treg主要表达CCR8，而健康供体外周血中的肿瘤Tconv和自然Treg几乎不表达该分子。这些CCR8肿瘤Treg在mRNA和蛋白水平上高度表达与Treg相关的分子，如CD25和CTLA-4。其他癌症，包括鳞状非小细胞肺癌、结直肠癌、卵巢癌（透明细胞癌）和膀胱癌，在肿瘤组织中仅在Treg中表达CCR8，而不在Tconv中表达。这些癌症组织中CCR8阳性细胞在Treg中的频率有所不同，但始终明显高于Tconv。基因表达谱分析显示，外周血和肿瘤中分离的CD4 + T细胞证实了肿瘤与循环Treg中CCR8的差异表达，并且前者在个体患者中表达了更高水平的Treg相关分子。
因此，在人类肿瘤组织中，差异化、功能稳定且克隆扩增的调节性T细胞在CCR8细胞群中高度富集。此外，在各种人类淋巴和非淋巴组织中，CCR8表达仅限于调节性T细胞，具有较高的基尼指数。CCR8本身似乎不会影响细胞的重要功能，这是通过功能丧失不耐受性评分（31）评估的。这些结果共同表明，CCR8可以成为特异性靶向肿瘤浸润性调节性T细胞以增强肿瘤免疫力的合适候选分子。
以上结果促使作者研究CCR8细胞耗竭或CCR8分子阻断对抗肿瘤免疫反应的影响，通过给携带肿瘤的小鼠注射抗CCR8 mAb（克隆SA214G2）进行治疗，该抗体属于大鼠IgG2b型，具有抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和阻断活性。静脉注射抗CCR8 mAb治疗CT26结肠癌或EMT6乳腺癌细胞皮下接种后的第5天，或者两次治疗（第5天和第12天）接种Renca肾癌细胞的小鼠，导致肿瘤生长显著抑制，超过一半的治疗小鼠完全消除了肿瘤。
为了确定抗肿瘤效应主要是由于CCR8分子的功能抑制还是CCR8 Tregs的消耗，作者对SA214G2抗CCR8 mAb进行了修改，通过在Fc部分引入L234A、L235A和P329G的替代物来削弱其ADCC活性（32）。这种抗CCR8 ΔADCC mAb在与自然杀伤细胞共培养时，对CCR8过表达的RAMOS细胞没有表现出ADCC活性，而在CCR8过表达的HEK293T细胞中，它显示出体外阻断活性，即β-阻滞素在CCR8中的招募受损。通过ADCC完整的抗CCR8 mAb对CCR8细胞的消耗，使肿瘤内的Foxp3细胞数量至少减少到未经处理的对照肿瘤的三分之一，持续至少1周（超过第一周，萎缩的肿瘤中的T细胞数量太少，无法分析）。相比之下，以相同剂量治疗CT26携带的小鼠的ΔADCC mAb未能减少肿瘤组织中的Foxp3细胞数量，并且只显示出较弱的抗肿瘤活性；例如，ΔADCC和原始mAb的根除率分别为13%和75%。
为了确定CCR8 Treg的耗竭是否会引发自身免疫性炎症以及上述所描述的有效肿瘤免疫，作者对接受抗CCR8依赖的选择性Treg耗竭或全身性Treg耗竭的小鼠进行了免疫学和病理学检查。在Foxp3（FDG）小鼠中，人二白喉毒素（DT）受体在Foxp3启动子的控制下表达（6），有限时间内（肿瘤细胞接种后第5天和第7天各注射一次DT），完全耗竭了外周血液、淋巴结、脾脏和肿瘤中的Foxp3 Treg，导致肿瘤消失。然而，这些小鼠出现了脾肿大和淋巴结肿大，明显高滴度的胃壁细胞自身抗体（作为器官特异性自身免疫的标志）和抗双链DNA自身抗体（作为全身性自身免疫的标志）（5）。这些小鼠还出现了大量单核细胞浸润和各种器官细胞/组织破坏，包括胃。与这种系统性Treg耗竭相比，一次在第5天用抗CCR8 mAb治疗的小鼠在淋巴结、脾脏或血液中没有明显减少Tregs，除了在肿瘤组织中，整个Tregs和CCR8 + Tregs显著减少到对照小鼠的三分之一。它们没有出现组织炎症、脾肿大、淋巴结肿大或循环自身抗体的明显组织学表现。
因此，选择性减少肿瘤中的调节性T细胞（Tregs）而不影响其他淋巴组织的抗CCR8单克隆抗体（mAb）治疗，在正常小鼠中并未引发组织学和血清学上明显的自身免疫或免疫病理学反应。然而，需要确定该治疗是否会通过耗竭自身免疫组织病变中的CCR8 Tregs，加剧某些自身免疫疾病中正在进行的自身免疫反应。
接下来，作者通过单细胞RNA测序分析评估了在抗CCR8、抗PD-1或对照mAb治疗后的第9天，第12天和第16天进入肿瘤的Tregs和Tconvs的基因表达谱。抗CCR8和抗PD-1 mAb分别以50和200μg的剂量给予，以确保在肿瘤接种后的第12天所有组的肿瘤大小相似。在第12天的三个组的合并UMAP图中，Treg群体由Leiden组（L组）2、8（均为G1细胞周期）和16（为G2M/S细胞周期）组成，通过Foxp3、Il2ra、Ikzf2、Cd4和细胞周期相关基因的表达来判断。在这个时间点上，抗CCR8治疗组显示了L组2 Tregs的减少，但保留了L组8和16 Tregs。L组2显示了更高水平的Treg激活相关基因表达，如Il2ra、Gzmb、Maf和Tnfrsf4。L组2与8的基因集富集分析（GSEA）显示，在L组2中Treg vs. Tconv UP基因集的富集显著高于L组8（34）。一致地，Treg功能相关基因（例如Icos，Il2ra，Gzmb，Tnfrsf4和Ikzf2）在抗CCR8处理组的Treg群体（L组2、8和16）中被下调。
总的来说，抗CCR8单克隆抗体治疗有选择性地消耗高度抑制性的肿瘤Treg细胞群体，这种消耗只持续有限的时间，足以促进CD8 T细胞转化为效应/记忆性T细胞，并使它们能够持续攻击肿瘤细胞而不会耗竭。
随着对抗CCR8的治疗对CT26负荷小鼠中效应/记忆型CD8 T细胞的明显扩增，作者在对抗CCR8单克隆抗体治疗期间和之前消耗了CD8 T细胞，并发现消耗显著减弱了抗肿瘤免疫力，表明CD8 T细胞在Tconvs中起到了关键的效应作用。通过MHC/gp70四聚体染色检测特异性结合CT26特异性肿瘤抗原gp70的效应型CD8 T细胞，确实发现与对照组或抗PD-1治疗相比，抗CCR8单克隆抗体治疗显著增加了gp70四聚体结合的CD8 T细胞，且TOX表达减少。在gp70特异性CD8肿瘤Tconvs中，干扰素-γ/肿瘤坏死因子-α双阳性细胞的频率增加，非细胞因子产生细胞的数量减少，尤其是通过抗CCR8单克隆抗体治疗。CD4 Foxp3肿瘤Tconvs同样更丰富地产生这些细胞因子，并且在抗CCR8单克隆抗体治疗后更具增殖能力。
接下来作者研究了抗CCR8介导的Treg消减是否会特异性地减少肿瘤抗原反应性的克隆扩增Tregs。作者在背部的两个部位接种CT26肿瘤细胞，然后分析在第9或第14天切除的肿瘤中浸润的TCRβ T细胞的TCR克隆型，在第9天进行抗CCR8、抗PD-1或对照mAb治疗之前或之后进行分析。在由Foxp3和Cd4表达定义的Treg群体中，Ccr8表达与克隆型大小呈良好相关；抗CCR8 mAb治疗特异性地消减了克隆型大小≥2的肿瘤Tregs。此外，在治疗前检测到的扩增的TCR克隆型在抗CCR8 mAb治疗后被选择性地减少，而在抗PD-1或对照mAb治疗后几乎没有变化，这些治疗保留了治疗前扩增的克隆型。与肿瘤Tregs不同，抗CCR8或抗PD-1 mAb治疗后，多克隆肿瘤浸润的CD4或CD8 Tconvs没有明显减少。
作者还尝试确定通过抗CCR8单克隆抗体治疗来清除肿瘤Treg是否能够赋予针对肿瘤相关抗原的效应性T细胞长期记忆。在抗CCR8治疗后约20天，已经清除了CT26肿瘤的小鼠，作者在第85天对小鼠进行了10倍数量的CT26或EMT6癌细胞的挑战。另一组接种了CT26的小鼠在第20天进行了肿瘤切除手术，并在之后的CT26或EMT6癌细胞挑战中进行了类似的处理。在第85天（即抗CCR8单克隆抗体治疗后80天）进行肿瘤再挑战时，血清中的抗CCR8单克隆抗体浓度微乎其微。在抗CCR8治疗组中，所有再接种的CT26肿瘤都迅速被摧毁，而EMT6肿瘤则没有。相比之下，在手术切除肿瘤的组中，对CT26和EMT6肿瘤的抗肿瘤免疫反应几乎没有检测到。此外，在抗CCR8治疗组中，CT26特异性gp70四聚体CD8 T细胞在CT26肿瘤再挑战后在外周血中显著扩增，而其他组中没有。肿瘤体积与血液中gp70四聚体CD8 T细胞浓度之间存在明显的负相关，突出了gp70四聚体CD8 T细胞在抗CCR8治疗和CT26再挑战组中对拒绝次级肿瘤挑战的关键作用。即使在主要CT26肿瘤接种后的约187天后，仍然得到了类似的结果。
至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：文章首先深入地探讨了肿瘤组织中Foxp3表达的CD25+CD4+调节性T细胞的特性；第二部分详述了它们在肿瘤免疫反应中的作用；第三部分描述了肿瘤相关抗原如何激活这些Tregs；第四部分讨论了通过针对CCR8的治疗策略对肿瘤的治疗效果及其未来的应用前景。全文内容详实，为作者提供了许多免疫学研究的新视角和生信分析的方向，对于研究免疫的朋友们来说是一篇不容错过的好文章！
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