导语
今天给同学们分享一篇多热点机制+预后+实验的生信文章“Identification and validation of a prognostic signature of autophagy, apoptosis and pyroptosis-related genes for head and neck squamous cell carcinoma: to imply therapeutic choices of HPV negative patients”,这篇文章于2023年1月10日发表在Front Immunol期刊上,影响因子为8.786。
人乳头瘤病毒(HPV)阳性的HNSCC患者通常具有良好的生存率,并对放疗、化疗放疗和检查点阻断有良好的反应。然而,HPV阴性患者,也就是大多数HNSCC患者,一直被忽视。细胞死亡已经与癌症治疗抵抗有关。为此,作者旨在确定自噬、凋亡和焦亡相关基因与HNSCC预后的关联,并构建一个预后标志来预测HNSCC的预后,特别是HPV阴性的HNSCC。
1. 与头颈部鳞状细胞癌患者的总体生存相关的自噬、凋亡和焦亡相关基因
作者在TCGA数据集中使用单变量Cox回归分析筛选了48个与整体生存相关的自噬、凋亡和焦亡相关基因。与上述基因的临床病理特征相关的特征显示在图1A中。使用LASSO回归模型选择了27个基因,使用逐步多元Cox回归模型选择了16个基因。这16个与整体生存相关的基因包括五个与凋亡相关的基因(BCAP31、CDKN2A、FNTA、STK24和YWHAQ)、十个与自噬相关的基因(ATG5、CSNK2A2、DYNC1I1、MVB12A、MVB12B、RRAGA、TSG101、PRKN、VDAC1和VPS37C)以及一个与焦亡相关的基因(NLRP1)(图1B)。随后作者分析了这些与整体生存相关的基因之间的相关性(图1C)。STK24与YWHAQ呈正相关,与MVB12A呈负相关,而DYNC1I1与PRKN呈正相关,相关系数绝对值超过0.4。
图1 整体生存相关的自噬、凋亡和焦亡相关基因的鉴定
2. 细胞死亡指数是头颈部鳞状细胞癌患者总体生存的独立预后指标
基于16个与总生存相关的基因,作者建立了自噬、凋亡和焦亡指数以及综合细胞死亡指数(CDI)。TCGA数据集中,CDI得分高的HNSCC患者的总生存率较差(中位数为20个月,95%置信区间[CI]为18至29个月),与CDI得分低的患者相比(中位数为110个月,95% CI为90个月至未达到)。这一发现在GEO数据集(GSE42743和GSE65858)以及山东大学齐鲁医院的数据集中得到了进一步验证(图2A)。类似的趋势也在CDI得分高的患者中观察到,他们的总生存率较差,与CDI得分低的患者相比(分别为GSE42743中的中位数11个月对35个月,GSE65858中的57个月对62个月,以及齐鲁医院队列中的24个月对未达到)。
图2 CDI是HNSCC整体生存率的独立预后指标
ROC分析显示,CDI在预测一年、三年、五年和十年总生存期方面表现出色,其ROC曲线下面积(AUC)分别为0.773、0.779、0.739和0.791(图2E)。自噬指数、凋亡指数、火凝亡指数和16个总生存期相关基因的AUC低于CDI。此外,CDI对于预测五年总生存期的AUC高于其他潜在的生存相关因素,包括年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期、肿瘤分级和HPV状态(图2F)。在单因素Cox回归模型中,CDI、凋亡指数和自噬指数与不良预后相关,而火凝亡指数与良好预后相关(危险比[HR]为4.00,95% CI为2.90-5.70,P <0.001,分别为CDI,HR为2.60的凋亡指数,HR为3.60的自噬指数和HR为0.61的火凝亡指数,图2G)。在多因素Cox回归模型中,CDI是独立的总生存期预后指标,在调整年龄、性别和TNM分期后(HR为3.80,95% CI:2.70-5.40,P <0.001,图2G)。
作者还基于多变量Cox模型开发了一个基于TCGA数据集的图表模型,用于预测HNSCC患者一年、三年和五年的总体生存概率(图2H)。该图表显示,CDI是最大的贡献因素,其次是年龄、TNM分期和肿瘤分级。在校准图中,观察到的和图表预测的总体生存曲线非常吻合(图2I)。作者的图表模型表现可靠,具有0.735的一致性指数(C-index)。
3. CDI对HPV阴性的头颈部鳞状细胞癌患者具有更强的预后效果,高CDI头颈部鳞状细胞癌患者通过放疗获得生存益处
作者进一步研究了CDI对整体生存率的影响,根据基线因素和其他已知影响生存率的因素,在TCGA数据集中进行了分层分析(图3A、B)。在除HPV阳性HNSCC患者外的所有亚组中,发现了类似的趋势。这一有趣的发现解决了作者对HPV状态分层的关注,尤其是对于大多数HNSCC,即HPV阴性患者。
图3 CDI对HPV阴性HNSCC患者显示出更强的预后效应,并与放疗的生存益处相关
为了评估高或低CDI分数的HNSCC患者是否从放疗或化疗放疗中获得不同的生存益处,作者使用TCGA数据集分析了高和低CDI HNSCC患者根据辅助治疗分层的总体生存概率(图3C,D)。在接下来的分析中,只有一个接受单独化疗的患者被排除在外。接受放疗的HNSCC患者在高CDI亚组中显示出良好的总体生存率,但在低CDI亚组中没有(P = 0.009和P = 0.938,分别,图3C)。值得注意的是,在HPV阴性亚组(P = 0.059,图3D)和HPV阳性患者(P = 0.045)中也发现了类似的趋势。综上所述,这些发现表明,尽管高CDI分数的HPV阴性患者表现出最差的预后,但他们仍可能从放疗中获得总体生存益处。
4. 低CDI HNSCC患者在HPV阴性HNSCC亚组中表现出活跃的免疫微环境
作者使用TCGA数据集评估了高和低CDI HNSCC患者的免疫环境。低CDI评分的HPV阴性HNSCC患者显示出更高的免疫评分和微环境评分(图4A)。然而,在HPV阳性患者中,高CDI和低CDI亚组之间的上述评分差异并未发现。为了评估具有不同CDI评分的HNSCC患者的免疫细胞浸润情况,作者应用了去卷积算法(图4B,S5C)。在HPV阴性和阳性HNSCC患者中,高CDI亚组中的静息记忆CD4 T细胞和M0巨噬细胞浸润更高。然而,在HPV阴性HNSCC亚组中,只有低CDI亚组中才有更多的原始B细胞、CD8 T细胞、活化记忆CD4 T细胞、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞和静息肥大细胞。
图4 高和低CDI HNSCC在HPV阴性亚组之间的免疫景观
此外,为了评估CDI评分在免疫检查点阻断中的潜在疗效,作者使用TCGA数据集检查了HNSCC患者高CDI亚组和低CDI亚组之间14个关键免疫检查点基因的表达情况。作者发现,在HPV阴性的HNSCC患者中,CTLA4、IDO1、TIM3、LAG3、PD1、SIGLEC10、LILRB1和NKG2A的表达在低CDI亚组中增加(图4C),但在HPV阳性的HNSCC患者中没有增加。这表明,CDI评分低的HPV阴性患者可能会从检查点阻断治疗中获益。
5. 低CDI HNSCC患者在HPV阴性HNSCC亚组中显示了与免疫功能相关通路的基因富集
考虑到CDI对HPV阴性和HPV阳性患者的不同预后影响,以及HPV阴性HNSCC患者中高CDI和低CDI亚组之间的不同免疫微环境,作者进一步分析了具有不同CDI评分的HPV阴性HNSCC患者的差异表达基因。共鉴定出288个差异基因,其中51个基因在高CDI亚组中上调表达,237个基因在高CDI亚组中下调表达(图5A)。
图5 不同CDI评分的HPV阴性HNSCC患者的功能丰富性
GO富集分析显示,低CDI亚组中上调基因主要富集在与免疫功能相关的通路中,包括免疫系统过程调节、淋巴细胞激活、免疫应答调节、淋巴细胞激活调节、B细胞激活、B细胞分化和B细胞增殖。然而,高CDI亚组中上调基因很少富集在与免疫功能相关的通路中(图5B、C)。
KEGG富集分析显示,高CDI亚组中上调基因主要富集在与代谢相关的途径中,包括色氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢和苯丙氨酸代谢。而低CDI亚组中上调基因主要富集在与免疫功能相关的途径中,包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、抗原处理和呈递、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用和T细胞受体信号通路(图5D、E)。
6. 两个HPV阴性HNSCC细胞系中与总生存相关的十六个基因的表达
为了验证数据库分析的结果,作者使用qRT-PCR测量了两种HPV阴性HNSCC细胞(CAL27和SCC-15)中与总体生存相关的16个基因的基线mRNA表达水平(图6A)。在自噬抑制剂氯喹(CQ)的作用下,CAL27和SCC-15细胞的细胞存活率显著受到抑制(图6B)。此外,作者发现CQ在两种细胞系中诱导了凋亡(图6C,D)。自噬相关蛋白(LC3和p62)在CQ的作用下被诱导,bcl-2减少,caspase-3被剪切,表明CQ可能抑制自噬并诱导凋亡(图6E)。除了两个低表达基因(PRKN和MVB12B)外,上述与总体生存相关的基因在CAL27细胞系中在CQ处理后均被诱导。在SCC-15细胞系中,DYNC1I1、CSNK2A2和TSG101在CQ处理后被诱导,MVB12A减少(图6F)。
图6 验证16个与总生存相关基因在两种HPV阴性HNSCC细胞系中的表达情况
7. 辐射诱导HPV阴性HNSCC细胞系中的细胞凋亡和VDAC1表达
作者进一步确定了一个不同表达的基因VDAC1,在HPV阴性HNSCC患者的辐射敏感和辐射耐受亚组之间(图7A)。VDAC1的表达在辐射敏感亚组中显著降低。体外实验中,CQ和/或辐射显著抑制了CAL27和SCC-15细胞系的细胞存活率(图7B)。作者进一步发现,CQ和/或辐射诱导了CAL27和SCC-15细胞系的凋亡(图7C,D)。此外,VDAC1在CQ和/或辐射处理后在CAL27和SCC-15细胞系中被诱导表达(图7E)。
图7 辐射增强了HPV阴性HNSCC细胞系中VDAC1的表达
总结
总之,作者确定了16个与自噬、凋亡和焦亡相关的基因,并构建了一个细胞死亡指数(CDI),CDI能够独立预测HNSCC患者的预后。CDI得分高的HNSCC患者可能会从放疗中受益,而HPV阴性且CDI得分低的患者可能会从检查点免疫疗法中获得潜在的益处。作者的研究结果不仅建立了一个预后标志,还强调了它在HPV阴性HNSCC患者中的治疗选择的实施,这是HNSCC的大多数患者和预后不良的人群。
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