为了确定WRN损失对具有不同MMR状态的CRC细胞的影响，作者使用小干扰RNA（siRNA）在3个MSI CRC细胞系（包括HCT116、RKO和LoVo）和2个MSS CRC细胞系（包括SW480和SW620）中敲低（KD）WRN。通过转移携带野生型（WT）MLH1和MSH3的染色体3和5来纠正MMR缺陷的同源HCT116细胞（HCT116 CH3+5）（24）被用来进一步控制基因背景的影响。WRN耗竭显著降低了MSI细胞的存活能力，这通过细胞存活性的MTS分析，可行细胞的结晶紫染色以及长期细胞存活的集落形成实验得到证实。这些效应在MSS CRC细胞中明显受阻。只有在WRN KD的MSI CRC细胞中才检测到线粒体介导的凋亡标志物，包括Annexin V阳性染色，线粒体细胞色素c的胞质释放以及caspase 3和9的裂解。在HCT 116细胞中，使用pancaspase抑制剂z-VAD-fmk（z-VAD）对细胞进行预处理，抑制了Si WRN引起的细胞存活率下降和凋亡。
2.WRN缺乏激活了MSI CRC细胞中的p53凋亡通路
为了确定WRN耗竭如何杀死MSI CRC细胞的机制，作者对转染了Si WRN的母细胞和对照CH3+5 HCT116细胞进行了mRNA测序（RNA-Seq）。作者发现了超过3,000个差异表达基因，其中包括1,085个上调基因和1,997个下调基因，在HCT116细胞中，而在CH3+5细胞中只有990个改变的基因。基因集富集分析（GSEA）显示，p53和凋亡途径是WRN KD最显著激活的途径之一。所发现的变化包括众所周知的p53下游靶基因，如p21（CDKN1A）、PUMA（BBC3）、Noxa（PMAIP1）、Gadd45 A和B、14-3-3σ以及Thrombospondin 1，以及其他凋亡调节因子，如BAK1、DR4、FAS、cIAP2和FLIP。这些数据促使作者进一步研究p53介导的凋亡信号传导。作者发现，在HCT116细胞中，WRN KD 48小时后，p53被强烈诱导。与RNA-Seq数据一致，WRN KD显著诱导了HCT116细胞中p53下游凋亡靶点的mRNA和蛋白表达，包括PUMA、Noxa和Bax，与p53诱导和caspase活化同时发生。这些效应在CH3+5细胞中几乎没有观察到。
作者随后调查了p53下游凋亡调节因子的功能作用。PUMA或BAX的敲除（KO），而不是Bim、Noxa或BAK，挽救了转染Si WRN的HCT116细胞的存活能力，表明p53/PUMA/Bax轴在诱导凋亡中起到了关键作用。事实上，p53或PUMA的KO完全抑制了HCT116细胞中WRN KD引起的细胞存活能力丧失、细胞色素c释放、Bax线粒体转位以及caspase 3和9的裂解。在具有WRN KD的MSI LoVo细胞中也观察到了p53和PUMA KO的类似效果。WRN KD在母细胞中激活了p53上游的DNA损伤信号，但在CH3+5 HCT116细胞中没有激活，例如ATM（Ser1981）和Chk2（Thr68）的磷酸化。ATM激酶抑制剂Ku55933的处理抑制了WRN KD诱导的p53及其上游和下游信号的诱导，表明ATM/Chk2/p53介导的DNA损伤应答信号。综上所述，这些结果表明WRN损失触发了DNA损伤诱导的p53/PUMA介导的凋亡，以杀死MSI CRC细胞，这需要p53 K120乙酰化。
p53基因突变在MSI肿瘤中相对较少，与MSS肿瘤相比（23）。广泛使用的MSI结直肠癌细胞系大多表达野生型p53；但是一些细胞系表达突变型p53，包括DLD1和HCT15，它们具有相同的遗传起源和p53突变（p.S241F），但具有不同的核型（33），以及KM12和LS411N（15, 16）。一项先前的研究显示，在分析的18个MSI细胞系中，只有DLD1和HCT15不受WRN KD的影响（16）。事实上，WRN KD未能引起DLD1细胞的存活能力丧失和p53/PUMA表达。相反，通过同源重组将野生型p53插入（KI）到DLD1细胞中（34），完全恢复了p53和PUMA的诱导，细胞存活能力丧失以及WRN KD引起的caspase 9和3的活化。在p53-KI DLD1细胞中，PUMA KD通过siRNA抑制了WRN KD引起的caspase活化。类似地，将野生型p53转染到HCT15细胞中，恢复了WRN KD引起的PUMA和凋亡的诱导。在CRISPR KO MLH1的p53突变型SW620细胞中，也观察到了WRN KD未能诱导PUMA和凋亡的现象。
为了研究WRN在体内的作用，作者构建了稳定的WT、PUMA-KO和CH3+5 HCT116细胞系，这些细胞系具有可诱导表达WRN小发夹RNA（Sh WRN）的强力霉素（Dox）诱导表达。预期地，通过Dox处理48小时以上，WRN的耗竭显著诱导了两个独立的WT HCT116克隆中的p53和PUMA表达、半胱天冬酶活化以及存活率下降，但在PUMA-KO和CH3+5 HCT116细胞中没有这种现象。然后，作者将这些细胞系植入裸鼠体内，建立异种移植瘤，并使用含有Dox的饮食诱导WRN的敲除。WRN敲除的诱导显著抑制了WT而不是PUMA-KO和CH3+5 HCT116移植瘤的生长。由于WRN表达的恢复，肿瘤生长在后期时间点增加。WRN敲除对不同组的体重没有影响。
为了探索WRN靶向作为治疗微卫星不稳定结直肠癌的方法，作者首先测试了之前描述过的小分子WRN解旋酶抑制剂NSC617145（35）。6 μM的NSC617145可以选择性地抑制HCT116亲本细胞而不影响CH3+5细胞，这伴随着p53/PUMA的诱导以及p53/PUMA依赖的细胞存活率下降和凋亡诱导。ML216最初被鉴定为Bloom (BLM)解旋酶的抑制剂，可以在IC50值分别为5和12.6 μM的条件下抑制全长WRN和缺乏N-末端外切酶结构域的截短衍生物（36）。尽管人类成纤维细胞在WRN基因表达正常或缺失的情况下对ML216同样敏感（36），但该抑制剂尚未在微卫星不稳定型癌细胞系中进行过测试。在父细胞与CH3+5 HCT116细胞中，以8 μM的浓度处理ML216 72小时，但不是更高的浓度，导致细胞存活率下降更多，PUMA诱导和凋亡增加。
为了探索WRN靶向治疗MSI结直肠癌的转化潜力，作者分析了ML216对PDX模型的抗肿瘤效果，这些模型比细胞系异种移植更好地重现了原始患者肿瘤的组织学、异质性和分子改变（37）。作者扩增并分析了三个来自国家癌症研究所（NCI）的PDX模型，包括MSS PDX-S1模型和两个MSI PDX-I1和PDX-I2模型，它们都携带MSH2和MSH6基因的突变和/或缺失。通过分析五个微卫星标记物的贝塞斯达面板，验证了这些PDX模型的MSS/MSI状态。ML216治疗显著抑制了PDX-I1和PDX-I2肿瘤的生长，但对PDX-S1肿瘤没有影响，同时没有影响体重。
至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：作者首先详细的探讨了微卫星不稳定性（MSI）与Werner (WRN)解旋酶的关系；第二部分描述了其在结肠癌细胞中如何强烈诱导p53及其下游的凋亡目标PUMA；第三部分介绍了WRN的消耗或使用RecQ解旋酶抑制剂ML216对MSI CRC的影响；第四部分叙述了p53/PUMA介导的凋亡在MSI CRC对WRN丧失的脆弱性中的关键作用，以及WRN作为治疗靶点的前景。全篇知识点丰富，有很多值得作者深挖的生信分析的切入点，做结肠癌研究的小伙伴不要错过啦！
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