为了系统地表征人类肝癌的复杂转录结构，作者使用具有高分辨率和可扩展区域的立体序列处理新鲜或新鲜冷冻的T和P，M以及正常或转移性LN，并通过scRNA-seq分析了一些样。作者从 98 个样本从病理诊断为原发性肝癌的10例患者中获得。15个样品来自4名患者用于scRNA-seq分析。载玻片中每个光斑中的细胞成分由SPOTlight测定26以scRNA-seq数据为参考，对9种主要细胞类型进行了空间注释（恶性细胞和胆管细胞被指定为一种主要细胞类型;T细胞和NK细胞也合并为一种主要细胞类型）。作者将每个点分配给具有最高概率比例的特定细胞类型. 经典细胞类型标记基因在确定的细胞簇中的较高表达支持了用于这些载玻片中斑点的细胞类型注释的基本原理。在这里，使用苏木精和伊红（H&E）对邻近组织切片进行染色，以帮助确认恶性细胞的位置及其在Stereo-seq载玻片中的空间分布。
四个区域（T、M、P和LN）的细胞组成和空间分布高度异质，除了主要的恶性细胞和肝细胞外，T/NK细胞、B细胞和成纤维细胞是最丰度的细胞。根据病理学家根据相邻H&E染色图像确定的肿瘤边界，边缘区域在空间上分为边缘区域的肿瘤相邻部分（M-T）和边缘区域的副肿瘤部分（M-P）。在肿瘤中观察到的内皮细胞和浆细胞比其他区域多，而成纤维细胞和巨噬细胞往往富集在M-T而不是肿瘤组织中，而B细胞在LN中最多。边缘区域的副肿瘤部分积累的成纤维细胞比副肿瘤组织中的成纤维细胞多。与副肿瘤组织相比，在边缘区域的副肿瘤部分观察到更高的PI3K/AKT/mTOR信号传导、IL6/JAK/STAT3信号传导和脂质代谢（包括脂肪生成和胆固醇稳态）的途径富集更高，而与边缘区域的副肿瘤部分相比，在副肿瘤组织中观察到与脂肪酸代谢相关的途径的富集更高。对于LNs，与其他区域相比，观察到与其他区域相比，与干扰素γ反应和细胞因子-细胞因子受体相互作用相关的基因富集更高。根据差异表达分析，与其他区域相比，与其他区域相比，与炎症反应相关的基因的表达水平在边缘区域上调。这些数据表明，肿瘤边缘区域可能是一个复杂的区域，其特征是缺氧微环境、强烈的炎症反应和高免疫逃逸。
作者进一步表征了边缘区域的肿瘤细胞和其他细胞成分（主要是肝细胞）中存在癌症标志和代谢变化。通常，与副肿瘤侧的细胞相比，肿瘤细胞表现出更低的缺氧反应，较高的糖酵解水平和更高的增殖能力。与远离边界的层相比，距离边界的第一层中的肿瘤细胞表现出缺氧反应途径、血管生成和EMT特征的激活增加。分别代表缺氧细胞和血管细胞的HIF-1α和CD31的IHC染色也支持它们在第一层肿瘤侧的富集。与肿瘤侧的外两层相比，在最靠近边界的层的肿瘤细胞中也观察到细胞凋亡增加和增殖能力降低。此外，与脂肪酸代谢相关的途径，包括脂肪酰辅酶A合成和脂肪酸β氧化，在第一层的肿瘤细胞中上调。为了解决沿边界可能存在的空间异质性，作者进一步分析了入侵区沿边界切向的细胞的多样性和状态。基于Stereo-seq数据，作者进一步将每张载玻片中的侵袭区划分为100个相等的亚区，从除恶性细胞、胆管细胞和肝细胞以外的所有亚区中提取细胞成分，并研究了2912名患者侵袭区~16个亚区的相似性。 亚区一般分为五种模式（模式1：成纤维细胞占优势;模式2：成纤维细胞和巨噬细胞占主导地位;模式3：巨噬细胞显性;模式4：B细胞和T/NK细胞占主导地位;模式5：内皮细胞显性）基于亚区之间的细胞组成。
在对scRNA-seq数据中的所有肝细胞进行重新聚类后，主要来自SAA2和SAA1表达水平最高的边缘区域的第2簇和主要来自SAA0和SAA1表达水平最低的副肿瘤组织的簇2分别被指定为Hep1和Hep2。根据Stereo-seq数据和scRNA-seq数据，Hep340和Hep1之间有2个常见的过表达基因。 急性期蛋白基因（包括SAA1，SAA2，血红素（HPX），口粘蛋白1（ORM1），口粘蛋白2（ORM2））和几种炎症介质（包括载脂蛋白A5（APOA5）和补体C3（C3）在Hep1中的较高表达表明这些细胞的受损和炎症状态。通常上调的基因还富集了补体和凝血级联反应、细胞凋亡和胆固醇代谢，揭示了Hep1的先天免疫相关反应和肝细胞损伤。
为了探索导致 SAA 在 Hep1 亚型中高表达的机制，单细胞调控网络推理和聚类 （SCENIC） 分析30应用了特定的转录因子（TF），包括FOSB，KLF6，NFKB1，STAT3，CEBPB，STAT2和ETV6，与Hep1相比，基于scRNA-seq数据。 一些TF，包括KLF2，CEBPB，STAT4和BHLHE6，在ENCODE中被注释为SAA3和SAA40的潜在TF。31或已发布的数据。28,32根据scRNA-seq数据，仅在Hep3亚型中观察到STAT1与SAA2或SAA1之间的正相互作用，但其他均未显示出显著关系。作者通过多重IF染色进一步验证了STAT3在侵袭区SAAs肝细胞（Hep1）中更高的表达水平。在验证队列 4 和 3 的相邻组织的 RNA-seq 和蛋白质数据中也观察到 SAA 表达水平与 STAT2 之间的显着正相关。总的来说，作者的数据表明，肝肿瘤细胞可以通过分泌CXCL6和随后在侵袭区激活JAK-STAT3途径来诱导肝细胞中SAA的过表达。
使用scRNA-seq数据对配体-受体相互作用的分析进一步表明，侵袭区的肝细胞和巨噬细胞也可以通过SAAs-TLR2相互作用相互作用，已被证明可将巨噬细胞极化为M2样表型。38作者的数据还表明，恶性细胞可以通过侵袭区的CSF2-CSF1R或CSF1-SIRPA相互作用，将巨噬细胞直接极化为M1样表型。侵袭区的巨噬细胞表现出M2样表型，CD163、MRC1和SAAs受体TLR2表达增加，而肿瘤组织中的巨噬细胞表现出ECM重塑的特征，MMP9和MMP14的表达增加。此外，侵袭区的巨噬细胞也表现出多种细胞因子和趋化因子基因的上调表达。 来自 105 名原发性肝癌患者的多重 IF 染色结果（验证队列 1）和另外 93 名 ICC 患者（验证队列 3）的 IHC 结果还显示，与肿瘤组织或副肿瘤组织的其他区域相比，巨噬细胞在侵袭区积累的 M2 表型。 流式细胞术也检测到SAA诱导的M2表型（CD68CD206）巨噬细胞比例增加，TLR2抑制剂处理可显着降低M2表型的百分比。综上所述，恶性细胞诱导的损伤肝细胞可以通过分泌SAAs在侵袭区募集M2极化巨噬细胞。
接下来，作者探讨了侵袭区受损肝细胞和募集巨噬细胞的临床意义。来自验证队列1的ICC患者，边缘区域的SAA2和SAA2表达水平增加与ICC患者的总生存期（OS）较差显着相关。通过IHC分析，其他93例ICC患者（验证队列3）也证实了SAAs在侵袭区的预后意义。 具体而言，侵袭区SAAs肝细胞的高比例与原发性（P < 0.01）和继发性肝癌（P < 0.05）患者的OS较差显著相关。此外，通过对来自验证队列93的3例ICC患者的样本进行IHC染色，作者发现侵袭区SAAs表达与副肿瘤组织之间存在较强的正相关关系，表明副肿瘤组织中受损的肝细胞反映了侵袭区检测到的损伤。总的来说，作者的数据表明巨噬细胞通过侵袭区受损肝细胞分泌SAAs而被特异性募集并极化为M2表型。这导致局部微环境的免疫抑制增加，促进肿瘤进展。Saas的敲低抑制了肿瘤生长，表明SAAs抑制可能代表了原发性和继发性肝癌的潜在治疗策略。
至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：文章首先深入地探讨了肝癌中的侵袭区域，特别是肿瘤边缘周围的癌症生态系统；第二部分描述了这对肿瘤细胞的浸润和侵袭的重要意义；第三部分揭示了强烈的免疫抑制、代谢重编程和严重受损的肝细胞的存在；第四部分叙述了肝细胞在侵袭区域的SAAs过表达可能导致的肿瘤进展，以及未来的研究方向。全篇内容详实，为作者提供了许多值得进一步研究的生信分析的思路，做肝癌研究的小伙伴一定要看看哦！
联系客服
