导语
今天给同学们分享一篇8+自噬+实验验证的生信文章“MAPK8 and CAPN1 as potential biomarkers of intervertebral disc degeneration overlapping immune infiltration, autophagy, and ceRNA”,这篇文章于2023年5月30日发表在Front Immunol期刊上,影响因子为8+。
椎间盘退变(IDD)是老年人最常见的健康问题之一,也是腰背痛(LBP)的主要致病因素。越来越多的研究表明,IDD 与自噬和免疫失调密切相关。因此,本研究的目的是确定IDD中与自噬相关的生物标志物和基因调控网络以及潜在的治疗靶点。
图1 流程图
1.确定 DEGs
本研究将两个高通量测序数据集 GSE176205 和 GSE167931 归一化并合并成一个数据集。然后在数据分析前对合并后的数据集进行批次效应消除(图 2A、B)。使用 R 中的 limma 差异基因分析软件包从合并数据集中获得了 636 个 DEGs,其中包括 468 个上调基因和 168 个下调基因(图 3A、B)。
图2 GEO 数据集预处理
图3 与 IDD 相关的 mRNA 差异表达
2.DEGs 的富集分析
为了进一步探索这些筛选出的 DEGs 的潜在生物学变化,研究人员利用 DAVID 在线数据库进行了 KEGG 和 GO 富集分析,并将其导出到 R 环境中进行可视化。KEGG结果显示,DEGs主要富集在肌萎缩性脊髓侧索硬化症、冠状病毒病(COVID-19)、志贺氏菌病、沙门氏菌感染和内质网蛋白质加工中。排名前 15 位的 KEGG 通路大多属于免疫相关疾病(图 4A、B)。GO BP(生物过程)注释结果显示,DEGs 主要富集在染色质组织、蛋白质自磷酸化和自噬中。前 15 个 GO 生物过程显示 DEGs 与自噬密切相关(图 4C,D)。
图4 DEGs 的功能富集分析
基因集 h.all.v2022.1.Hs.symbols 被用于 GSEA 分析。排除无统计学意义的结果后,MITOTIC_SPINDLE、IL2_STAT5_ SIGNALING、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB和UV_RESPONSE_DN在IDD中被显著激活(图5),表明这些生物学过程可能与IDD密切相关。
图5 对照样本与 IDD 样本之间 HALLMARK 的 GSEA 分析
3.确定 DE-ARGs
为了进一步探索IDD中的自噬相关基因(ARGs),作者 将从MsigDB数据库中获得的404个ARGs与从人类自噬数据库中获得的232个ARGs合并,得到了总共547个ARGs。然后将这些ARGs与DEGs交叉,得到30个DE-ARGs(图6A)。使用 DAVID 数据库对 DE-ARGs 进行 KEGG 和 GO 分析,以 p < 0.05 为阈值,并在 R 软件中将富集结果可视化(图 6B, C )。
图6 自噬相关差异表达基因的鉴定
4.构建 PPI 并确定关键基因
作者 使用中等置信度的STRING数据库探索了30个DE-ARGs之间的相互作用,得到了一个包含30个节点和24条边的PPI网络(图7A)。利用 Cytoscape 的内部分析插件 MCODE,对 DE-ARGs 的 PPI 网络进行了筛选,以获得聚类得分最高的子网络,并将其可视化(图 7B)。如图所示,作者 假设 MAPK8、CTSB、PRKCD、SNCA、CAPN1 和表皮生长因子受体是关键基因。
图7 筛选 DE-ARGs 中的关键基因
综合数据集中这六个中枢基因的热图和三维 PCA 图显示,对照组与 IDD 组有显著差异(图 7C、D)。在 GSE176205 和 GSE167931 数据集中,这六个中枢基因的 AUC 值均在 0.75 以上,表明这六个中枢基因具有很好的诊断性能,可作为诊断 IDD 的生物标记物(图 7E)。
5.IDD 免疫细胞浸润的变化
作者 使用 CIBERSORT 算法评估了正常样本和 IDD 样本中浸润免疫细胞亚型的相对丰度。条形图和热图显示了每个样本中多种免疫细胞亚型的浸润情况(图 8A)。小提琴图显示了两组样本中免疫细胞百分比的差异(图 8B)。与正常样本相比,IDD 样本中 CD8 + T 细胞和 M0 巨噬细胞的浸润增加,而 CD4 记忆性静息 T 细胞、中性粒细胞、静息树突状细胞、滤泡辅助性 T 细胞和单核细胞的浸润减少(图 8C)。
图8 IDD 组和对照组细胞浸润的可视化
最后,热图显示了中枢基因与免疫细胞浸润之间的相关性(图 8D)。如图所示,各亚型中枢基因的表达与免疫细胞浸润显著相关。IDD 样本中 CD4 记忆静息 T 细胞的减少与高表达的 CAPN1 和表皮生长因子受体呈负相关,而与 MAPK8、CTSB 和 PRKCD 的表达呈正相关。
6.潜在的 mRNA-miRNA-lncRNA (ceRNA) 中枢基因网络
为了揭示这六个关键基因潜在的转录后调控机制,作者 筛选了IDD发育过程中差异表达的miRNA和lncRNA,并构建了一个ceRNA网络。在R软件中使用limma软件包对GSE167199中的DE-miRNA和DE-lncRNA进行鉴定和筛选,以|log2FC|>1和p<0.05为显著性阈值。共鉴定出 139 个 DE-lncRNAs 和 65 个 DE-miRNAs(图 9A、B)。
图9 构建六个中心基因的 ceRNA 网络
随后,利用ENCORI在线数据库预测了6个关键基因的目标miRNA,并与DE-miRNA相交,得到mRNA-miRNA结合对。此外,还利用 mirNet 数据库预测了上一步筛选出的 DE-miRNA 的可能结合 lncRNA,并将预测的 lncRNA 与 DE-lncRNA 相交,构建了 miRNA-lncRNA 结合对。然后将 mRNA-miRNA 和 miRNA-lncRNA 结合对进行整合,构建出六个中心基因的 ceRNA 网络(图 9C、D)。
7.中心基因的验证
结果显示,X 射线、核磁共振成像和 NP 组织切片的 H&E 染色显示,IDD 大鼠模型的 NP 严重受损(图 10A)。反转录 qPCR(RT-qPCR)分析表明,IDD 模型中聚集蛋白多糖(aggrecan)和 II 型胶原(COL-2)的 mRNA 水平下降(图 10B)。作者 检测了 IDD 模型中枢基因的 mRNA 表达。结果显示,与其他关键基因不同,只有 CAPN1 和 MAPK8 的表达与作者 的 DEGs 分析结果一致(图 10C)。此外,作者 还以 p < 0.05 作为筛选阈值,对 CAPN1 和 MAPK8 与免疫细胞亚型浸润进行了相关性分析(图 10D)。因此,CAPN1 和 MAPK8 被确认为 IDD 进展的最终关键基因。
图10 正常大鼠和 IDD 模型中枢基因的表达水平
总结
综上所述,作者 利用生物信息学方法分析了IDD的DEGs,包括DEGs的功能富集分析、自噬相关DEGs的获得、PPI网络分析和体外qPCR验证。此外,作者 还进行了免疫细胞浸润分析和lncRNA-miRNA-mRNA网络构建,并研究了IDD中免疫细胞浸润与ceRNA网络之间的相关性。在动物实验中,作者 验证了两个关键基因(MAPK8 和 CAPN1)在 mRNA 水平上的表达,这与生物信息学分析的结果一致。作者的研究为IDD的发病机制提供了新的见解,并有助于确定IDD发病机制中新的潜在治疗靶点。
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