导语
今天给同学们分享一篇8+自噬+实验验证的生信文章“MAPK8 and CAPN1 as potential biomarkers of intervertebral disc degeneration overlapping immune infiltration, autophagy, and ceRNA”，这篇文章于2023年5月30日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8+。
椎间盘退变（IDD）是老年人最常见的健康问题之一，也是腰背痛（LBP）的主要致病因素。越来越多的研究表明，IDD 与自噬和免疫失调密切相关。因此，本研究的目的是确定IDD中与自噬相关的生物标志物和基因调控网络以及潜在的治疗靶点。
图1 流程图
1.确定 DEGs
本研究将两个高通量测序数据集 GSE176205 和 GSE167931 归一化并合并成一个数据集。然后在数据分析前对合并后的数据集进行批次效应消除（图 2A、B）。使用 R 中的 limma 差异基因分析软件包从合并数据集中获得了 636 个 DEGs，其中包括 468 个上调基因和 168 个下调基因（图 3A、B）。
图2 GEO 数据集预处理
图3 与 IDD 相关的 mRNA 差异表达
2.DEGs 的富集分析
为了进一步探索这些筛选出的 DEGs 的潜在生物学变化，研究人员利用 DAVID 在线数据库进行了 KEGG 和 GO 富集分析，并将其导出到 R 环境中进行可视化。KEGG结果显示，DEGs主要富集在肌萎缩性脊髓侧索硬化症、冠状病毒病（COVID-19）、志贺氏菌病、沙门氏菌感染和内质网蛋白质加工中。排名前 15 位的 KEGG 通路大多属于免疫相关疾病（图 4A、B）。GO BP（生物过程）注释结果显示，DEGs 主要富集在染色质组织、蛋白质自磷酸化和自噬中。前 15 个 GO 生物过程显示 DEGs 与自噬密切相关（图 4C，D）。
图4 DEGs 的功能富集分析
基因集 h.all.v2022.1.Hs.symbols 被用于 GSEA 分析。排除无统计学意义的结果后，MITOTIC_SPINDLE、IL2_STAT5_ SIGNALING、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB和UV_RESPONSE_DN在IDD中被显著激活（图5），表明这些生物学过程可能与IDD密切相关。
图5 对照样本与 IDD 样本之间 HALLMARK 的 GSEA 分析
3.确定 DE-ARGs
为了进一步探索IDD中的自噬相关基因（ARGs），作者 将从MsigDB数据库中获得的404个ARGs与从人类自噬数据库中获得的232个ARGs合并，得到了总共547个ARGs。然后将这些ARGs与DEGs交叉，得到30个DE-ARGs（图6A）。使用 DAVID 数据库对 DE-ARGs 进行 KEGG 和 GO 分析，以 p < 0.05 为阈值，并在 R 软件中将富集结果可视化（图 6B, C ）。
图6 自噬相关差异表达基因的鉴定
4.构建 PPI 并确定关键基因
作者 使用中等置信度的STRING数据库探索了30个DE-ARGs之间的相互作用，得到了一个包含30个节点和24条边的PPI网络（图7A）。利用 Cytoscape 的内部分析插件 MCODE，对 DE-ARGs 的 PPI 网络进行了筛选，以获得聚类得分最高的子网络，并将其可视化（图 7B）。如图所示，作者 假设 MAPK8、CTSB、PRKCD、SNCA、CAPN1 和表皮生长因子受体是关键基因。
图7 筛选 DE-ARGs 中的关键基因
综合数据集中这六个中枢基因的热图和三维 PCA 图显示，对照组与 IDD 组有显著差异（图 7C、D）。在 GSE176205 和 GSE167931 数据集中，这六个中枢基因的 AUC 值均在 0.75 以上，表明这六个中枢基因具有很好的诊断性能，可作为诊断 IDD 的生物标记物（图 7E）。
5.IDD 免疫细胞浸润的变化
作者 使用 CIBERSORT 算法评估了正常样本和 IDD 样本中浸润免疫细胞亚型的相对丰度。条形图和热图显示了每个样本中多种免疫细胞亚型的浸润情况（图 8A）。小提琴图显示了两组样本中免疫细胞百分比的差异（图 8B）。与正常样本相比，IDD 样本中 CD8 + T 细胞和 M0 巨噬细胞的浸润增加，而 CD4 记忆性静息 T 细胞、中性粒细胞、静息树突状细胞、滤泡辅助性 T 细胞和单核细胞的浸润减少（图 8C）。
图8 IDD 组和对照组细胞浸润的可视化
最后，热图显示了中枢基因与免疫细胞浸润之间的相关性（图 8D）。如图所示，各亚型中枢基因的表达与免疫细胞浸润显著相关。IDD 样本中 CD4 记忆静息 T 细胞的减少与高表达的 CAPN1 和表皮生长因子受体呈负相关，而与 MAPK8、CTSB 和 PRKCD 的表达呈正相关。
6.潜在的 mRNA-miRNA-lncRNA (ceRNA) 中枢基因网络
为了揭示这六个关键基因潜在的转录后调控机制，作者 筛选了IDD发育过程中差异表达的miRNA和lncRNA，并构建了一个ceRNA网络。在R软件中使用limma软件包对GSE167199中的DE-miRNA和DE-lncRNA进行鉴定和筛选，以|log2FC|>1和p<0.05为显著性阈值。共鉴定出 139 个 DE-lncRNAs 和 65 个 DE-miRNAs（图 9A、B）。
图9 构建六个中心基因的 ceRNA 网络
随后，利用ENCORI在线数据库预测了6个关键基因的目标miRNA，并与DE-miRNA相交，得到mRNA-miRNA结合对。此外，还利用 mirNet 数据库预测了上一步筛选出的 DE-miRNA 的可能结合 lncRNA，并将预测的 lncRNA 与 DE-lncRNA 相交，构建了 miRNA-lncRNA 结合对。然后将 mRNA-miRNA 和 miRNA-lncRNA 结合对进行整合，构建出六个中心基因的 ceRNA 网络（图 9C、D）。
7.中心基因的验证
结果显示，X 射线、核磁共振成像和 NP 组织切片的 H&E 染色显示，IDD 大鼠模型的 NP 严重受损（图 10A）。反转录 qPCR（RT-qPCR）分析表明，IDD 模型中聚集蛋白多糖（aggrecan）和 II 型胶原（COL-2）的 mRNA 水平下降（图 10B）。作者 检测了 IDD 模型中枢基因的 mRNA 表达。结果显示，与其他关键基因不同，只有 CAPN1 和 MAPK8 的表达与作者 的 DEGs 分析结果一致（图 10C）。此外，作者 还以 p < 0.05 作为筛选阈值，对 CAPN1 和 MAPK8 与免疫细胞亚型浸润进行了相关性分析（图 10D）。因此，CAPN1 和 MAPK8 被确认为 IDD 进展的最终关键基因。
图10 正常大鼠和 IDD 模型中枢基因的表达水平
总结
综上所述，作者 利用生物信息学方法分析了IDD的DEGs，包括DEGs的功能富集分析、自噬相关DEGs的获得、PPI网络分析和体外qPCR验证。此外，作者 还进行了免疫细胞浸润分析和lncRNA-miRNA-mRNA网络构建，并研究了IDD中免疫细胞浸润与ceRNA网络之间的相关性。在动物实验中，作者 验证了两个关键基因（MAPK8 和 CAPN1）在 mRNA 水平上的表达，这与生物信息学分析的结果一致。作者的研究为IDD的发病机制提供了新的见解，并有助于确定IDD发病机制中新的潜在治疗靶点。
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