研究表明，在细胞系和小鼠模型中，TP53 突变会导致 NF-κB 依赖性慢性炎症的增加。Tg（NFκB:EGFP）斑马鱼转基因系可以监测炎症主调控因子 NF-κB 的信号活性，通过使用该转基因系，作者比较了常规饲养（CR）的野生型（WT）斑马鱼和在 tp53 DNA 结合域中携带错义突变的 tp53 e7/e7 突变体的受精后 7 天（dpf）肠道 NF-κB 活性。与之前的研究结果一致，与 WT 幼体相比，7 dpf 时 tp53 突变体幼体肠道中段的 NF-κB 依赖性 EGFP 强度显著上调。为了确定在 tp53 突变体中观察到的 NF-κB 信号的升高是否是由肠道微生物群引起的，作者对在 GF 条件下饲养的 WT 和 tp53 突变体幼虫的肠道 NF-κB 信号进行了检测。在 GF 条件下，CR tp53 突变体中增加的 NF-κB-EGFP 信号消失了，这表明 CR tp53 突变体中的微生物群是炎症增加的原因。同时，与 WT 对照组相比，7 dpf 时 tp53 突变体幼虫中段肠道中经 Alcian 蓝染色的鹅口疮细胞数量增加，并且这种增加在 GF 条件下被阻断，这也揭示了这种表型对微生物群的依赖性。
根据 16S rRNA 扩增子测序对 tp53 突变体中富集的细菌进行了详细的操作分类单元（OTU）分析，结果显示气单胞菌属、假单胞菌属和柠檬杆菌属是 CR tp53 突变体中异常增加的主要细菌群。作者还尝试分离可培养的幼虫肠道细菌，以便与 16S rRNA 基因分析结果进行比较。在有氧和厌氧培养条件下，作者成功地从 tp53 突变体的胃肠中培养出了詹达伊气单胞菌（Aeromonas jandaei）、奥特氏假单胞菌（Pseudomonas otitidis）和自由柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），并将它们归类为 CR tp53 突变体中异常丰富的细菌种类。在接下来的实验中，被命名为 A. jandaei TP531 的 A. jandaei 菌株被确定为选择性过度繁殖 tp53 突变体胃肠道的关键代表性病原菌。
为了检测A. jandaei TP531是否是导致CR tp53突变体胃食管中观察到的NF-κB信号上调和上皮细胞数量增加的病原菌，首先通过施用高剂量（2 × 10 7 菌落总数形成单位（CFU）/毫升）的A. jandaei TP531来检测斑马鱼幼体的致死率。在这些条件下，两种基因型的细菌都会导致死亡，而 tp53 突变体比 WT 更易受 A. jandaei TP531 感染。此外，暴露于滴度不断升高的 A. jandaei TP531 会以细菌浓度依赖性的方式导致上睑下垂细胞数量增加，tp53 突变体宿主对细菌敏感，与 WT 宿主相比，在滴度较低时表现出最大反应作为对照，暴露于非致病性大肠杆菌 DH10B既不会诱导致死，也不会增加两种基因型的上睑下垂细胞数量。作为另一个对照，在两种基因型中，光杆菌 Damselae DreWT1（一种从 WT 内脏中分离出来的共生细菌菌株）既不会增加致死率，也不会增加 NF-κB 依赖性 EGFP 表达。A. jandaei TP531在通过 Tg监测的 WT 胃肠道中也引起了 NF-κB 信号的升高，这表明 A. jandaei TP531 是一种炎症刺激性病原体。
尽管作者的证据表明，tp53突变体表现出与菌群失调相关的肠道免疫反应升高，其中促炎症病原菌被选择性地富集，但目前还不清楚是菌群失调的微生物群还是tp53宿主微环境足以引起炎症反应升高。为了解决这个问题，作者进行了外-GF 实验，其中 GF 生长的 WT 或 tp53 突变体宿主从 3 dpf 开始与 7 dpf WT 或 tp53 突变体的肠道微生物群平行或相互关联，并在 7 dpf 评估 NF-κB 信号的任何变化。WT 宿主与 7 dpf tp53 突变体胃肠道菌群失调微生物群结合所产生的 NF-κB 信号活性与 WT 宿主对原始 WT 微生物群的反应没有显著差异，表明 tp53 突变体菌群失调微生物群不足以诱导异常的 NF-κB 信号转导。与此相反，7 dpf WT 细菌与 tp53 突变体宿主的结合引起了显著增加的 NF-κB 信号转导反应，表明 tp53 突变体宿主提供的微环境对 NF-κB 信号转导的增强至关重要。tp53突变体宿主与tp53突变体细菌的结合并没有促进反应，这可能是由于信号饱和所致。
作者将糖代谢作为另一个候选途径进行研究，并特别关注 SAs，这是一个重要的九碳单糖家族，主要分布在糖蛋白糖链的非还原端，覆盖在宿主肠道上。众所周知，SAs 通过调节宿主新陈代谢、细菌生存和免疫监视，对宿主与细菌之间的相互作用至关重要[ 42]。在 CR 和 GF 条件下，WT 和 tp53 突变体中涉及宿主 SA 代谢的几个基因表达不同，包括硅烷基转移酶和硅烷基糖苷酶，这意味着 Tp53 依赖性和微生物群依赖性 SA 代谢异常。斑马鱼幼体消化道中发现的主要 SAs 是 N-乙酰神经氨酸（Neu5Gc）和 N-乙酰神经氨酸。使用带荧光检测器的高效液相色谱法（HPLC-FLD）直接测量了7 dpf时WT和tp53突变体剖开的消化道中Neu5Gc和Neu5Ac的含量。在 CR 和 GF 条件下，tp53 突变体 GIT 中 Neu5Gc 的水平都比 WT GIT 中的水平异常升高，而 Neu5Ac 的含量没有显著差异。这与 tp53 突变体中唾液酸代谢基因的异常表达特征一致，与微生物的存在无关，进一步支持了 tp53 突变体宿主在菌群失调和炎症期间 SAs增加的作用。
为了检验宿主的sialid酶是否是OV处理的靶标，作者使用HPLC-FLD检测了经或未经OV处理的7 dpf全身标本中游离和总SAs的数量。在 tp53 突变体中，游离 Neu5Gc 和全身 Neu5Gc 的总含量都异常增加，类似于在 tp53 突变体中观察到的 GIT Neu5Gc 总含量。重要的是，尽管 OV 处理强烈抑制了与气单胞菌相关的致死率和促炎表型，但 1 μM OV 处理与否，游离和总 Neu5Gc 水平没有显著差异，表明宿主 sialid 酶不太可能是导致表型变化的 OV 靶标。作为硅ialid 酶活性的另一种可能来源，作者使用 Philippin A（PA）测试了细菌硅ialid 酶的参与情况，PA 是一种已知的强效细菌硅ialid 酶抑制剂，从 Flemingia philippinensis 的根中分离出来[68]。PA 对细菌硅糖苷酶的抑制作用来自非竞争机制，不同于 OV 的竞争性抑制机制[69]。与 OV 处理的效果类似，mCherry 标记的 A. jandaei TP531（1 × 10 4 CFU/mL）与 1 μM PA 处理后，NF-κB 信号的升高被显著抑制，mCherry 标记的 A. jandaei TP531 菌落数显著减少。不同条件下的菌落总数没有统计学差异。因此，这些结果共同表明，在 tp53 突变体中，细菌硅糖苷酶活性是导致这种促炎病原体过度生长和炎症反应增强的原因，而化学抑制剂可以抑制这些表型，但不会影响微生物群落的整体密度。
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