为了揭示 CRC 细胞在 RT 后的免疫逃逸机制，作者使用多参数流式细胞术系统地评估了 HCT116 和 HT29 两种人类 CRC 细胞系与接受或不接受 8-Gy 照射的正常 CCD-33Co 细胞上各种免疫检查点的表达水平。作者的结果表明，与正常细胞相比，CD47和PD-L1在基线时在CRC细胞上的表达更高，RT 24小时后它们的表达进一步上调。此外，在使用光子（8 Gy）或质子[8 cobalt Gy equivalent (CGE)]的HCT116和HT29细胞中也持续观察到RT诱导的CD47和PD-L1上调，CD47和PD-L1表达的增强与剂量有关，并在RT后至少持续6天。作者还观察到，与使用 1.8 或 5 Gy 每分剂量方案凋亡的癌细胞相比，RT 诱导的 CD47 和 PD-L1 上调在存活的癌细胞中更为明显。RT 会诱导 CRC 患者的 PD-L1 表达（23）；然而，RT 诱导的 CD47 上调的临床意义仍不清楚。因此，作者比较了 30 例接受短程新辅助 RT和手术的直肠癌患者在放疗前和放疗后通过免疫组织化学（IHC）测量的 CD47 表面表达。与配对的治疗前活检样本相比，放疗后手术样本的 CD47 组织指数显著增加。
RT 可诱导癌细胞中细胞膜双链 DNA 的积累。吞噬含有细胞膜双链 DNA 的受损细胞可触发 cGAS-STING、下游 IFN 调控因子（IRFs）和核因子κB（NF-κB）信号，促进先天性免疫激活（32-34）。为了确定 ATR 消减是否会使辐照癌细胞易被巨噬细胞吞噬并促进巨噬细胞中的 IRF 和 NF-κB 信号转导，作者使用分化的 THP1-Dual 细胞进行了吞噬试验，这些细胞分别表达由 IRF 和 NF-κB 信号转导驱动的荧光素酶（Lucia）和分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。作者发现，RT 结合 ATRi 能显著增加 THP1-Dual 巨噬细胞对 HCT116 细胞的吞噬作用，再次证实了 ATR 激活在辐照后吞噬逃避中的作用。
由于抗SIRPα与抗CD47相比具有更好的抗肿瘤效果，作者在随后的实验中重点研究了抗SIRPα与RT和抗PD-1联合使用的治疗效果。鉴于 OVA 是一种高免疫原性的外来抗原，表达 OVA 的肿瘤模型可能无法再现人类 CRC 的免疫原性，因为大多数 TAAs 的免疫原性较弱或无免疫原性（35）。此外，与皮下 CRC 模型相比，结肠原位肿瘤由于其独特的肿瘤微环境（TME）而对免疫疗法更具抵抗力（36-38）。与单剂量照射相比，分次 RT 方案更常用于 CRC 患者。为了解决这些问题，作者将MC38-luciferase细胞正位植入盲肠，并将野生型（WT）MC38细胞皮下植入右翼。然后，作者使用或不使用抗SIRPα和抗PD-1抗体对右侧肿瘤进行了三次5 Gy的分次RT治疗。作者观察到，与使用抗SIRPα和抗PD-1或单独使用RT治疗的小鼠相比，三联疗法使照射肿瘤和腹腔肿瘤的存活率和CR率都得到了非常显著的改善。
为了比较不同处理中APCs的全局转录组变化，作者从辐照肿瘤中分离出CD11b − CD11c + DCs、CD11b + CD11c + DCs和CD11b + CD11c − 髓系细胞进行RNA测序分析。基因本体通路前10个富集路径的分层聚类显示，在RT/抗SIRPα/抗PD-1组的不同DC亚群中，适应性免疫应答和细胞因子产生相关通路显著富集。此外，在 CD11b + APC 群体中，三联疗法使先天性免疫反应、免疫效应过程和对病毒的防御反应通路显著丰富，突显了单核细胞系中先天性防御机制的深度激活。总之，这些数据表明，RT与抗SIRPα和抗PD-1抗体结合可大幅提高TAA在髓细胞区的交叉呈递、成本调控分子表达和细胞因子产生相关信号转导，最终赋予TAA高效的交叉免疫能力。
宿主免疫系统中 cGAS-STING 介导的 I 型 IFN 的产生是触发 RT 诱导的适应性免疫反应所必需的（8）。作者发现，抗SIRPα和抗PD-1抗体增强了经辐照的MC38-OVA细胞共培养的BM-DCs中cGAS的表达、STING和下游IFN调节因子3（IRF3）的磷酸化以及IFN-α和IFN-β的转录。此外，差异表达基因分析持续记录了体内 RT/抗-SIRPα/抗-PD-1 组不同髓系亚群中 I 型 IFN 产生（GO: 0032606）相关基因的富集情况，这表明辐照肿瘤细胞吞噬作用的增加增强了 cGAS-STING 先天免疫传感器回路的激活以及随后 APCs 中 I 型 IFN 的产生。为了探索宿主 STING 活性在体内对 RT/抗-SIRPα/抗-PD-1 的反应中的作用，作者将 MC38-OVA 细胞分别皮下注射到 WT 小鼠和 STING 缺失（STING −/− ）小鼠的两侧腹部，并用 8-Gy RT（右侧腹部）处理，同时使用或不使用抗-SIRPα 和抗-PD-1 抗体。
为了从功能上描述不同抗原递呈髓系亚群的交叉刺激能力，作者从接受或未接受 8-Gy 照射和/或噬血细胞治疗的 MC38-OVA 肿瘤中获取了 CD11b − CD11c + DCs（主要是 cDC1）、CD11b + CD11c + DCs、和 CD11b + CD11c − F4/80 + 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些巨噬细胞来自接受或不接受 8-Gy 照射和/或吞噬检查点阻断治疗的 MC38-OVA 肿瘤，用于 OT-1 细胞的体外交叉灌注。作者观察到，在与CD11b − CD11c + DCs共培养的OT-1细胞中，颗粒酶B、IFN-γ、Ki-67、ICOS、CD44和PD-1的水平最高，而与RT/抗-SIRPα/抗-PD-1组分选的TAMs共培养的OT-1细胞中，颗粒酶B、IFN-γ、Ki-67、ICOS、CD44和PD-1的水平最低，这表明TAA特异性CD8 T细胞的效应功能、增殖能力和活化状态都很出色。
作者接下来研究了RT/抗-SIRPα/抗-PD-1诱导的交叉引物能力的提高是否会导致TAA特异性CD8 T细胞的数量和功能引物的增强。RT/抗-SIRPα/抗-PD-1能显著增加H-2K b -SIINFEKL- tetramer + CD8 T细胞在辐照和腹腔肿瘤以及携带MC38-OVA肿瘤的小鼠外周血中的生成。这表明三联疗法能扩增和动员TAA特异性CD8 T细胞，这些细胞能浸润非辐照、TAA表达的肿瘤部位。在IL-10分泌的背景下，M2巨噬细胞/MDSCs的积累可促进调节性T细胞（T reg ）的分化和肿瘤的生长（44-47）。作者观察到，在RT/抗-SIRPα/抗-PD-1组的辐照TME中，FoxP3 + T regs 明显减少，CD8/T reg 比率增加，这表明髓细胞区系的再极化[M2巨噬细胞/MDSCs的减少和IL-10的减少]支持一种促炎T细胞谱。
为了进一步描述RT/抗SIRPα/抗PD-1扩增的抗肿瘤T细胞群的性质，作者对TCRβ CDR3进行了高通量测序，以全面描述携带MC38-OVA肿瘤的小鼠的肿瘤浸润CD8 T细胞谱系。肿瘤浸润的 CD8 T 淋巴细胞数量越多，越能预测直肠癌患者对新辅助化放疗的反应并降低复发风险（49，50）。同样，作者发现在 RT/anti-SIRPα/anti-PD-1 组中，照射肿瘤和缺损肿瘤中的 CD8 T 细胞数量都有所增加，这表明可能形成了细胞毒性 T 细胞的瘤内龛。T细胞克隆度越高，表明由少数几种优势克隆型构成的T细胞库比例越大，这与患者和临床前模型的卓越疗效有关（51-53）。作者的研究结果表明，单纯 RT 只增强了照射肿瘤的 CD8 T 细胞克隆性，而没有增强缺损部位的 CD8 T 细胞克隆性，这与已发表的结果一致（54）。
来个小总结：文章首先深入探讨了放疗对结直肠癌的影响及其在激发适应性免疫中的作用；接下来，作者详细描述了如何通过ATR介导的机制上调CD47和PD-L1来影响免疫应答；在第三部分，作者了解到了这种上调如何阻止抗原呈递细胞的吞噬，从而限制了TAA交叉呈递；而在第四部分，文章描述了这种机制对放疗后的免疫逃逸的影响及其治疗前景。这篇文章知识内容丰富，为作者提供了许多生信分析的新视角，对于从事免疫研究的朋友们来说，这是一篇不容错过的好文章！
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