导语
结果解读：
为了描述非小细胞肺癌（NSCLC）中的免疫景观，作者共收集了19名NSCLC患者（10例LUAD和9例LUSC）的肿瘤和相邻正常肺组织（NL）样本，共计40个样本。这些样本被切除后立即处理，生成富含活细胞的单细胞悬浮液，并直接使用分离的活细胞。随后，进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）以研究NSCLC两个亚型之间的免疫异质性（图1a）。更多技术细节，包括质量控制标准和过滤步骤，请参见方法和材料部分。此外，与解离相关的基因FOS、FUN和HIF1A在甲醛固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本中均有表达。因此，它们在后续分析中被保留下来。CD45作为一种全白细胞标记物，已被用于通过多参数流式细胞术定义白细胞。因此，在作者的研究中，所有获得的细胞中，CD45+细胞被确定为免疫细胞，并被选择用于后续分析（图1a）。总共，通过质量控制的有72,475个免疫细胞，涵盖了17,277个独特基因，其中有38,169个细胞来自肿瘤组织，34,306个细胞来自相邻正常组织，这些细胞都不是特定于患者或疾病的（图1c）。
对诱导LUAD和LUSC之间免疫异质性的关键因素进行研究，可以初步了解癌症亚型对免疫治疗的不同反应。17首先，与邻近组织相比，尽管一些免疫功能相关基因共存，但在两种主要的癌症亚型（HLA-D家族、NKG7、GNLY、，和免疫相关基因FCGR3A在LUAD中富集，而LUSC明显表达预后相关基因，如IGHG3、IGHG4、IGHG1和IGKC。此外，一些基因表现出细胞类型特异性表达，因此，作者进一步比较了两种亚型之间的重叠DEG，发现NK细胞、Gran和CD8细胞在LUAD和LUSC之间共享更常见的失调基因，而DC、Tregs、CD4细胞和Mφ的重叠基因较少。这些结果表明了癌症不同亚型的免疫特征的共同性和差异性。
为了进一步揭示这些免疫细胞在其微环境中的作用，作者随后调查了LUAD和LUSC之间各个细胞类型的免疫细胞组成和差异表达基因（DEGs）。治疗前患者不同组织来源的B细胞和肥大细胞的组成在这两种癌症亚型之间存在显著差异（P < 0.05，Kruskal-Wallis检验）（图2a），它们也共享最少的重叠基因（图）。所有免疫细胞类型都显示出癌症亚型特异的特征和功能（图2b、c），一些免疫球蛋白基因（IGKC、IGHG1、IGHG3、IGHG4和IGLC2）在LUSC组织的每个细胞类型中上调，与LUAD相比（图2b），据报道这些基因在肺癌中从正常组织到肿瘤和转移的T细胞中逐渐增加。XIST在LUAD中上调，促进了肺癌细胞的生长。此外，作者注意到在LUSC中高表达的DEGs，如SPP1、CD8A和CD8B，主要在淋巴细胞和髓系细胞中表达，而在LUAD中高表达的DEGs主要富集在髓系细胞中，尤其是巨噬细胞，例如FN1、LTA4H、OLR1和FBP1（图2b）。如图2c和补充图2d所示，除了B细胞外，淋巴细胞中特异表达的基因主要参与T细胞激活、细胞因子反应和干细胞分化，而髓系细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞，表达与脂质代谢相关的基因通路和免疫系统调节，从而导致LUAD和LUSC之间免疫微环境的差异。
TME的特点是不同细胞群之间复杂的细胞-细胞相互作用，最终调节肿瘤生长并导致局部侵袭/惨淡转移。为了探究癌症亚型中假定的细胞-细胞相互作用异质性，作者部署了一组免疫相关配体-受体（L–R）对，以深入了解作者研究中确定的所有免疫细胞类型之间的调节关系。27预计共有2612对L–R对介导肿瘤组织中所有免疫细胞的相互作用。根据DEG分析，Mφ通过LUAD和LUSC中的大量相互作用分子对与其他细胞类型积极相互作用（图3a）.在LUAD患者中，Mφ与DC、Gran、CD8细胞、B细胞和Tregs细胞类型的相互作用更为强烈，在LUSC患者中与DC、Gran、NK细胞的相互作用更强。Mφ也含有最多的配体和受体。
吸烟仍然是肺癌发生的最主要原因，LUSC与吸烟密切相关，而近年来非吸烟患者的LUAD诊断数量急剧增加，尤其是女性。因此，作者进一步研究了吸烟作为风险因素对肺腺癌免疫微环境的影响，发现有吸烟史的患者具有更多的DC、Mφ和肥大细胞，而无吸烟史的患者则富集了更多的Gran、CD4和CD8细胞。在DEGs方面，癌基因XIST、HIF-2α靶基因SCGB3A1和肿瘤坏死因子（TNF）靶基因HSPA6在非吸烟组细胞中高表达，而DDX3Y、SCGB3A2和CCL18在有吸烟史的患者细胞中过度表达，尤其是在Mφ中。先前有报道称CCL18会从乳腺癌相关Mφ释放出来，促进血管生成和肿瘤进展，作者进一步加深了对这一因子在肺癌中的理解。
对吸烟组和非吸烟组之间的差异表达基因进行功能分析显示，这些基因主要来自淋巴细胞，参与白细胞介素相关的信号通路。相反，来自髓系细胞的基因与T细胞激活、分化和细胞因子通路相关。GSEA还显示，富集在Notch、细胞因子和Fc_epsilon_RI信号通路中的基因在吸烟组中丰富，而在非吸烟组中上调的基因可以激活EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药性、ErbB（对癌症放疗和化疗耐药性的贡献）、PPAR、Wnt通路和ECM-受体相互作用（已知与非吸烟肺癌相关的通路）。
因此，作者推测免疫异质性对非吸烟患者的肿瘤进展和药物抗性产生了比吸烟患者更显著的影响。巨噬细胞和淋巴细胞是这种差异的细胞基础。
作者通过重新聚类15,853个CD4+ T细胞（图4a、b）确定了七个不同的细胞亚型，包括：幼稚型（CCR7 + SELL + ）、效应型（IFNG + CD44 + ）、调节型（IL2RA + FOXP3 + ）、耗竭型（PDCD1 + LAG3 + ）、记忆型（S100A4 + CD44 + ）、活化型（FOS + JUN + ）和γδT细胞（TRGC1 + TRDC + ）。具体而言，从肿瘤组织中获得了9,603个（60.58%）CD4+ T细胞，其中24.21%来自LUAD组织，36.37%来自LUSC组织（补充图5a）。CD4+ T细胞亚型的分布显示，与相邻组织相比，肿瘤组织中Tregs细胞富集，记忆细胞减少。此外，与LUSC相比，LUAD具有更多的效应型和活化型细胞，以及较少的Tregs细胞（图4b、c）。耗竭型、Tregs和效应型细胞获得了更多的差异表达基因（DEGs），揭示了它们在肿瘤免疫环境中的重要作用（补充图5b）。
Mφ在非小细胞肺癌（NSCLC）发展中的重要作用已经确立，但它们在LUAD和LUSC之间所承载的不同功能仍然大部分未知。一项先前的研究表明，Mφ可以进一步分为三个主要群体，即FABP4、SPP1和FCN1，并在特发性肺纤维化（IPF）的纤维化下叶中发挥多样化的作用。为了广泛研究两种NSCLC亚型之间Mφ的异质性，作者将11,016个Mφ基于特征基因重新聚类为四个离散的亚群，分别定义为FABP4、FCN1、SPP1和SELENOP-Mφ（图5a-c）。然而，每个标记物的表达并不完全局限于一个唯一的聚类，如小提琴图所示（图5c）。具体而言，作者观察到LUAD组织中有1407个FCN1（19.5%）、2873个SPP1（39.9%）、2562个FABP4（35.6%）和364个SELENOP（5%）的Mφ，而LUSC样本中则包含1381个FCN1（36.2%）、1698个SPP1（44.6%）、278个FABP4（7.3%）和453个SELENOP（11.9%）的Mφ。值得注意的是，FABP4-Mφ主要存在于LUAD中，而SPP1-Mφ在LUSC中更为丰富（图5b、d）。
为了识别巨噬细胞亚型特异基因表达的变化如何影响LUAD和LUSC之间的肿瘤免疫异质性，作者应用Monocle2重构了所有获取的巨噬细胞的伪时序轨迹推断（图6a、b）。Mφ轨迹产生了五个发育层次（状态1-5），其中FABP4-Mφ亚型位于细胞进化地图的起始点（图6a、b），并且暗示了一个二叉分支结构（图6b）：FABP4-Mφ作为根，SPP1-Mφ作为分支1的终点状态，以及SPP1-Mφ和FCN1-Mφ亚型作为分支2的终点状态。值得注意的是，新的亚亚型SELENOP-Mφ在整个发育轨迹中存在，并主要积累在分支2的末端（图6b）。LUAD和LUSC中Mφ的发育轨迹在起始状态上显示出明显的差异，这表明FABP4-Mφ在肿瘤发生发展中的重要性（图6b）。作者还确定了399个在分支1的伪时间中表达动态的差异表达基因，这是分支2中的一个子集。在分支2的终端状态State 2中，来自NL(AD)组织的细胞比NL(SC)组织富集得更多，这表明分支2可能对两种NSCLC亚型相邻组织中微小差异的Mφ发育轨迹做出更大贡献。
在确定Mφ亚群在非小细胞肺癌亚型中发挥不同功能，并且淋巴细胞也被认为对LUAD和LUSC之间的异质性有贡献之后，作者进一步研究了每个Mφ亚群与淋巴细胞的相互作用。通过R软件包CellChat（图7a），在这两种肺癌亚型中预测到了多个不同的细胞相互作用对。在LUAD中，FABP4-Mφ与SELENOP-Mφ、SPP1-Mφ、CD4细胞、CD8细胞、Tregs和NK细胞之间的相互作用比LUSC中更强，而SELENOP-Mφ和FCN1-Mφ与LUSC中的CD4和CD8细胞之间的相互作用得到了增强。
总结
作者的研究以单细胞分辨率全面描述了NSCLC的免疫状况，并确定了免疫微环境特征的亚型间差异。未来的研究需要在临床和实验上验证作者在评估免疫细胞群及其对患者的预后价值方面的发现。
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