导语
A Methylation-Based Reclassification of Bladder Cancer Based on Immune Cell Genes
基于膀胱癌免疫浸润相关的甲基化分型方法
一、研究背景
个体对免疫治疗的反应存在显着的异质性，并非所有的免疫疗法都能成功对患者有效。有几种类型的免疫疗法可以治疗膀胱癌，例如从膀胱内注射卡介苗芽孢杆菌可治疗高危非肌肉浸润性膀胱癌，但并非所有患者对上述疗法都有相同的反应，只有大约20％的患者可以从免疫疗法中显着受益。因此，必须开发准确的分类方法以帮助膀胱癌患者选择对免疫疗法反应的最佳方案。
二、结果解读
1. 基于甲基化位点（DMS）的亚组分型
作者从先前的研究中选择了782个与免疫细胞生物标志物相关的基因，并获得了8703个与免疫细胞生物标志物相关的甲基化位点。差异甲基化位点筛选条件为p值 0.2，在正常样品和肿瘤样品之间共鉴定出715个DMS。其中包含553个DNA低甲基化位点和162个高甲基化位点，并基于共识聚类分为三个亚型。亚型1甲基化水平适中，亚型2甲基化水平最高，而亚型3甲基化水平最低。主成分分析（PCA）用于确定共识分类的稳定性。
图1：基于亚甲基化位点的三个亚组
2. 不同甲基化亚型之间的临床症状
作者使用Kaplan–Meier方法分析了BC亚群的总生存曲线，这三种免疫亚型与不同的临床结果相关。亚型1的预后最差，亚型3的预后最好。接下来，作者在每组亚型之间进行了log-rank检验，发现仅在聚类1和聚类3之间存在显着差异（p值为0.009）。各亚型与临床症状的关系如图所示。除年龄外，三个亚组之间的其他临床病理特征均有显着差异。
图2：各亚组间总体生存曲线和临床病理特征
3. 不同的亚组之间的甲基化水平和基因表达水平
作者使用卡方检验比较了三个亚组之间的DNA甲基化水平和免疫基因表达水平，结果表明，这三个亚组之间的甲基化水平及免疫基因表达水平均存在显着差异。此外，作者在亚型1，亚型2和亚型3中分别发现了14个，540和136个具有较高表达水平的甲基化位点。亚型1和亚型2之间有14个甲基化位点重叠，而在其余亚型对中未发现重叠的甲基化位点。
图3：甲基化水平和基因水平
4.不同亚组之间的免疫浸润水平
作者进一步探讨了不同分组之间的免疫浸润水平。结果表明，亚型3的免疫浸润水平最低，而亚型2免疫浸润水平最高。此外，三个亚型之间的免疫检查点的表达水平均存在明显差异。肿瘤微环境包含基质细胞，肿瘤细胞和免疫细胞。基质评分和免疫评分越高，肿瘤的纯度越低。结果显示，亚型3具有最低的基质评分，免疫评分，以及最高的肿瘤纯度。
图4：三个亚组之间的免疫浸润水平
5.各亚型之间的通路富集分析
通过ssGSEA算法量化了APC、内皮细胞、成纤维细胞、HLA、IFN_Response等免疫评分，结果显示，各亚组之间免疫相关生物标志物的水平存在显著差异。内皮细胞可以重塑局部免疫微环境，并帮助肿瘤细胞以不同方式逃避免疫监测。内皮细胞不仅释放趋化因子以促进白细胞迁移进入肿瘤组织，而且表达粘附蛋白以促进外周白细胞的捕获。在本研究中，亚型2的内皮细胞水平最高，而亚型2的免疫浸润程度最高，这意味着内皮细胞可能帮助肿瘤细胞逃脱机体免疫机制。
图5：三个亚型之间的免疫相关分子生物标志物
6. 甲基化亚型与膀胱癌常用分类标准的比较
结果显示，亚型3具有最高的管腔标志物表达水平以及最低的鳞状/神经元分化标志物表达水平。亚型2具有最高的EMT表达水平。
图6：甲基化亚型与膀胱癌常用分类标准的比较
7. 亚组之间的干性评分比较
基因的异常调节可能导致癌症干细胞诱导DNA甲基化的发生。本研究进一步探讨各亚型之间的干性评分，结果显示，亚型2中RNAs和DNAss水平最低。
图7：RNA干性评分和DNA干性评分
8.三个亚组之间的SNP和CNV突变分析
本研究进一步探讨了各亚组之间的突变概况。结果显示，在每种亚型中，约有三十个免疫相关基因的突变比例最高，而三种亚型之间的重叠较少。此外，亚型1中ITGA9，ENG，EVI5，ATIC和FZD2的突变显着高于其他亚型的突变，亚型2中CTSZ，HOXA1和KLRF1的突变也显着升高，而亚型3中的DLC1，OSBPL1A，RRP12，C3AR1，MPZL1和ITK的突变明显高于其他亚型。TMB仅在亚型1和亚型2之间有显着差异。此外，CNV突变分析结果显示，亚型1仅有一个基因拷贝数显着增加，三个基因拷贝数显着减少，亚型2中有4个基因拷贝数显着增加，1个基因拷贝数显着减少，而在亚型3有两个基因拷贝数显著增加，四个基因拷贝数显著减少。三个亚型具有不同的SNP和CNV突变概况，表明针对三个亚组之间的靶向药物治疗应具有针对性。
图8：三个亚组之间的SNP和CNV突变分析
三、小结：
本研究基于免疫细胞相关的CpG位点，通过共识聚类将膀胱癌患者分为三组亚型，这三组亚组之间表现出不同的临床病理特征，免疫机制以及基因组改变，为肿瘤免疫微环境相关的膀胱癌治疗提供新的观点。此外，免疫相关的CpG位点还可以换成其他疾病相关的基因集，如代谢相关/自噬相关/转移相关，值得借鉴。
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