前言
Immune landscape and prognostic immune-related genes in KRAS-mutant colorectal cancer patients
发生KRAS突变结直肠癌患者的免疫情况概况
一、研究背景
KRAS突变是结直肠癌最常见的突变类型。KRAS突变能够作为EGFR-TKI耐药性的生物标记物并在鉴定抗表皮生长因子受体（EGFR）治疗，这些研究证据表明，KRAS突变对肿瘤免疫力有重要影响。KRAS突变免疫应答集群（CIRC）免疫基因/标志物的聚类分析包括28个基因，表明患者相对高比例的具有KRAS低抑制分子表达相关的集群中的突变。小鼠结肠肿瘤的免疫表型分析表明，KRAS突变与免疫抑制微环境之间存在关联，其特征在于T细胞浸润减少和髓样抑制细胞（MDSC）浸润增加。然而，尚未完全阐明患有KRAS突变的CRC患者的免疫情况和免疫相关基因的表达改变。
二、研究思路
三、结果解读
1 CRC患者的体细胞突变情况
作者首先在体细胞突变景观分析535例CRC患者的KRAS状况。检测到99.63％的人至少具有一种类型的基因突变。CRC中最常见的突变是腺瘤性息肉病（APC）基因，占79%，其次是肿瘤蛋白53（TP53）基因（61％）。KRAS突变是CRC中检测到的第三个常见突变，发生频率为42％。根据是否存在KRAS突变将患者分为两组，发生KRAS突变的患者中，发生APC，TP53和PIK3CA突变的频率最高，APC和PIK3CA的突变频率显著增加。在KRAS野生型患者中，突变频率最高的3个基因是APC，TP53和SYNE1（图1a），TP53和ZFHX4的突变频率显着增加。
图1 KRAS状态的结直肠癌（CRC）患者的体细胞突变景观
然后基于从KRAS突变体和KRAS获得的数据，使用GSEA对KRAS突变诱导的途径进行了评估野生型CRC患者。与KRAS野生型CRC患者相比，KRAS突变体中的几种免疫相关途径均被显着下调，包括Th1和Th2细胞分化，T细胞受体信号传导和核因子kappa-B（NF-κB）信号传导通路。基于生物学过程和分子功能的GSEA与KRAS突变相比揭示了KRAS突变体中几个与免疫相关的术语的抑制作用。KRAS野生型CRC患者。综上所述，这些数据表明KRAS突变与CRC中的免疫抑制有关。免疫检查点分子（例如PD-1）的表达是免疫治疗反应的有希望的预测因素。KRAS突变组中几个关键的免疫检查点相关分子（PD-L1，CTLA4和TIM-3，图1d）均显著下调，因此推测KRAS突变可能会抑制检查点分子。
2 有无KRAS突变的CRC患者免疫情况
接下来在528例CRC患者中（KRAS突变体n=224；KRAS野生型n=304）分析免疫状况，全面比较存在和不存在KRAS突变时免疫细胞浸润的范围。在不同个体TIICs的比例中观察到显著变化，TIIC比例的变化代表了个体差异的内在特征。相关分析表明，弱到中度的免疫细胞亚群的不同的正相关性（图 2B）。比较了不同类型免疫细胞之间的丰度。KRAS -突变型和KRAS -野生型纳入CRC患者（图 2 C）。与KRAS突变相比，B细胞的丰度，嗜中性粒细胞和巨噬细胞显著下调。与KRAS野生型CRC患者相比。考虑到免疫细胞具有多种亚型，使用CIBERSORT对免疫细胞进行进一步分型并验证TIMER的结果。
图2.有无KRAS突变的大肠癌（CRC）患者的免疫情况
比较KRAS突变体和KRAS之间22种免疫细胞的丰度在野生型组中，发现天然B细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞M1在KRAS突变组中显着下调，这是对TIMER结果的进一步完善。此外观察到在KRAS突变组中，活化的CD4记忆T细胞显着减少，但调节性T细胞（Tregs）显着增加（图2d）。高微卫星不稳定性（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）CRC由于肿瘤细胞的高度突变状态而表现出活跃的免疫微环境。排除了具有MSI-H或dMMR的样品，并重新分析了两组之间免疫微环境的差异。总共排除了72例患有MSI-H或dMMR的CRC病例，包括21个KRAS突变体和51个KRAS野生型。上述五个TIIC中的四个（天然B细胞，巨噬细胞M1，活化的CD4记忆T细胞和Treg，除嗜中性粒细胞外，两组之间有显着差异。进一步使用内部RNA测序数据来比较KRAS突变和KRAS野生型组中上述5种TIIC的丰度（KRAS突变组：n = 3；KRAS野生型群体：n = 5）。在KRAS突变组中，巨噬细胞M1也显着下调。对于其他几个TIIC，观察到与上述结果相似的趋势，但是由于样本量小，差异在统计上并不显着。
3 肿瘤浸润免疫细胞
（TIIC）签名的开发和验证
因为TIIC与KRAS突变相关，作者接下来研究TIIC是否与KRAS突变患者的生存相关。根据上述差异表达的TIICs进行了生存分析以识别KRAS突变患者的生存相关TIIC。观察到在患有KRAS突变的患者中，巨噬细胞M1的高丰度和活化的CD4记忆T细胞与更好的预后相关，而Tregs的高丰度与较差的预后相关（图3a）。天然B细胞和中性粒细胞的丰度与预后之间无显着相关性。使用独立的验证集（GSE39582）验证了这些结果，其中包括566例CRC的基因表达谱。生存分析同样表明，巨噬细胞M1和活化的CD4记忆T细胞用更好的预后相关联，而Treg的高丰度的患者与较差的预后相关联KRAS突变（图3b）中。进一步调查上述TIICs在KRAS野生型患者中的预后价值。在训练组中，只有巨噬细胞M1与KRAS野生型患者的生存率显着相关，以及巨噬细胞M1在KRAS中的预后价值野生型患者无法通过验证集进行验证。这些结果表明巨噬细胞M1，激活的CD4记忆T细胞和Tregs在KRAS突变CRC中具有更强的预后价值。
图3.肿瘤浸润免疫细胞标记的开发和验证
接下来进行了多元Cox回归分析以鉴定独立的预后TIIC，结果表明巨噬细胞M1，活化的CD4记忆T细胞和Treg是KRAS突变CRC的独立预后TIIC 。因此，巨噬细胞M1，活化的CD4记忆T细胞和Tregs的收集被定义为TIICs签名，以预测KRAS的预后。-突变CRC。基于TIICs签名，我们构建了一种计算TIICs签名分数（TIICs分数）的方法，计算方法如下：（-0.75×巨噬细胞M1的丰度）+（-0.84×活化的CD4记忆T细胞的丰度）+ （0.93×Treg的丰度）。TIICs评分成功地将KRAS突变CRC患者区分为高风险或低风险组。与那些在TCGA数据集（图3c）。TIICs标志物在验证集的KRAS突变CRC患者中产生了相似的结果。与低风险患者相比，高风险患者的OS较差。在训练组和验证组预测OS TIICs分数的ROC曲线下的AUC分别为0.75和0.68。
4 差异表达的IRGs KRAS
-突变型和KRAS野生型
CRC患者的差异表达的IRGs
比较IRGs的表达来探讨存在和不存在KRAS突变的CRC患者的免疫分子特征，作者使用edgeR算法确定了73个差异表达的IRG，其中具有KRAS突变的CRC中有24个上调而49个下调。使用富集分析探索了差异表达的IRGs影响的途径和生物学过程。体液免疫反应是与生物过程相关的最显著的途径。神经活性配体-受体相互作用，细胞因子-细胞因子受体相互作用和Ras信号通路是KEGG中前三个最重要的通路。分子功能富集分析确定受体配体活性是最常见的分子功能。这些结果表明大多数差异表达的IRG与信号转导相关。基于差异表达的IRG进行的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析结果检测到133条边缘，并鉴定出白蛋白（ALB），胰高血糖素（GCG），瘦素（LEP），胰岛素样生长因子2（IGF2），CRP和（血小板原蛋白）PPBP作为网络的核心基因。
5 整合TIIC和IRG来开发和
验证免疫风险（Imm-R）模型
免疫相关基因（IRG）可以协调肿瘤相关的免疫反应，TIICs签名和IRGs签名的集成可以实现对免疫状态的更全面评估和更精确的预后预测。使用单变量Cox回归分析对生存相关的IRG进行的初步筛选显示，在73个差异表达的IRG中，有13个与OS显着相关，大多数与生存相关的IRG（13个中有12个）被确定为预后不良的危险因素。通过多因素COX回归分析确定独立的预后因素。在接受多变量COX回归模型的13个基因中，确定了三个独立的预后因素，即VGF，RLN3和CT45A1。通过使用多变量COX回归分析TIICs签名和IRGs，构建了免疫风险（Imm-R）模型。VGF，RLN3，CT45A1和TIICs签名均为KRAS突变CRC的独立预后因素（图 4b）。在Imm-R模型中，使用以下公式生成免疫风险评分（Imm-R评分）：Imm-R评分=（0.165×VGF）+（0.453×RLN3）+（0.203×CT45A1）+（0.372×TIICs签名）。Imm-R模型可以有效区分具有临床预后良好和不良的KRAS突变CRC患者（图4c）。与低危患者相比，高危患者的生存期明显短。在验证集中进一步验证了KRAS突变CRC患者的Imm-R模型。Imm-R模型可有效区分预后良好或不良的KRAS突变CRC患者。在验证组中，高风险患者的OS显着低于低风险患者（图4 d）。在训练组和验证组预测OS IMM-R型的ROC曲线下的AUC分别为0.76和0.68，分别为（图4e）所示。
图4.免疫风险（Imm-R）模型的开发和验证
诺莫图是一个对用户友好的图形回归模型。为提高Imm-R模型的可用性，构建了一个诺模图来更好地描述Imm-R模型（图4f）。列线图包括四个要素，并根据顶部的比例为每个要素指定一个点。总分定义为八个变量的得分之和。通过从总点轴到两个结果轴画一条垂直线，可估算出三年和五年的OS概率。为评估诺模图的拟合优度，使用校准图将预测的三年和五年生存概率与实际的三年和五年生存概率进行比较（图4g，h）。校准曲线显示了三年和五年生存率的预测概率与观察到的概率之间的良好一致性。这些结果证明Imm-R模型具有非常合适的校准效果。
6 免疫浸润与Imm-R模型之间的关联
通过比较低风险和高风险CRC患者中22种免疫细胞的丰度，研究免疫浸润与Imm-R模型之间的关系。高危患者的天然B细胞，Tregs，巨噬细胞M0和活化的肥大细胞的丰富度显着增加，而CD8 + T细胞，活化的CD4记忆T细胞，滤泡辅助性T细胞，巨噬细胞M1和M2，静息树突状细胞和高危患者的嗜酸性粒细胞明显减少。为探索Imm-R模型的潜在生物学机制进行基因集富集分析（GSEA）。结果发现在那些高危患者中，与癌症或代谢相关的几种途径被显着激活，包括基底细胞癌，Wnt信号传导途径，黑色素生成和牛磺酸和低牛磺酸代谢，反映了高危患者中活跃的肿瘤代谢（图5b）。相反，在高危患者中，与免疫相关的几种途径，例如趋化因子信号传导途径，NF-κB信号传导途径和T细胞受体信号传导途径，均显着下调，提示高危患者的免疫抑制作用（图5c）。进一步研究IRG和TIICs表达之间的关联，发现FGF6与上述三个TIIC显着相关，这表明FGF6可能在具有KRAS突变的CRC患者的肿瘤微环境中发挥重要作用。
图5.Imm-R模型与免疫浸润相关性
7 存在KRAS突变的
CRC患者的全身免疫和炎症状态
通过比较335例CRC患者血液中免疫细胞，Igs，血小板和急性期蛋白（例如CRP和hs-CRP）的水平来评估局部肿瘤组织中异常免疫浸润的全身影响（KRAS突变）和234（KRAS野生型）。表1列出了与入组患者有关的临床信息。患者的平均年龄为59岁。与具有KRAS突变的患者相比，KRAS野生型患者中远处转移患者的比例显着更高。两组的年龄，性别，肿瘤位置和TNM（T描述肿瘤的大小和癌扩散到附近组织；N描述癌扩散到附近淋巴结；M描述转移）阶段相似。与KRAS野生型患者相比，KRAS突变体中hs-CRP，CRP和IgM的全身水平显着降低。两组患者的白细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，血小板，lgM，lgA，C3，C4，辅助性T淋巴细胞，抑制性T淋巴细胞，NK细胞和B淋巴细胞的数量相似。
表1.有无KRAS突变结直肠癌患者的临床特点
四、小结
作者通过535例CRC患者比较KRAS突变型和KRAS野生型CRC患者在肿瘤微环境中免疫相关基因（IRG）的表达和肿瘤浸润免疫细胞（TIIC）的丰度，分析存在KRAS突变时的全身免疫和炎症状态，建立并验证了由IRG和TIIC组成的免疫危险（Imm-R）模型并进行生存预后预测，证明了CRC中的KRAS突变与抑制的免疫途径和免疫浸润有关，异常的免疫途径和免疫细胞有助于了解KRAS突变CRC患者的肿瘤免疫微环境。
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