导语
今天和大家分享的是2020年10月份发表在Theranostic杂志(IF=8.579)的一篇文章“A panel of eight microRNAs is a good predictive parameter for triple-negative breast cancer relapse”。文章中证明了使用8-miRNA可以准确预测TNBC患者的复发，对进一步的临床预测有用。
A panel of eight microRNAs is a good predictive parameter for triple-negative breast cancer relapse
八个microRNA组是三阴性乳腺癌复发的良好预测指标
一、研究背景
乳腺癌（BC）由几种亚型组成，例如luminal A, luminal B,，HER2和三阴性乳腺癌（TNBC）。TNBC是一种具有耐药性（MDR）的乳腺癌，三至五年内具有高复发率和短的总体存活（OS）率。目前，由于缺乏有效的治疗靶点，TNBC的治疗策略仅限于手术，化学疗法和放射治疗。在肿瘤学领域，生物标志物通常具有三种临床相关性：诊断价值，预后价值和预测价值。肿瘤淋巴结转移（TNM）分期系统是基于肿瘤，局部淋巴结和转移部位特征的分类系统，但当前的TNM分期系统不足以识别高危患者。
二、结果解读
1 从公共数据集中筛选候选miRNA
图1.在TNBC中识别与复发相关的miRNA预测因子的工作流程
筛选重要的生物标记并验证TNBC中潜在的候选miRNA研究的工作流程如图1所示。在两个不同的数据集（TCGA_TNBC和GEOD-40525）获得了总共125个TNBC组织和15个相邻的正常组织。接下来，将p值和FDR阈值设置为小于0.05，然后分别在TCGA_TNBC和GEOD-40525中保留了109和44个miRNA，最后TCGA_TNBC和GEOD-40525数据集共有10个候选miRNA。
表1.TNBC患者的临床病理特征
表2.TCGA_TNBC和GEOD-40525数据集在TNBC组织中表达的10个候选miRNA
表2提供了通过维恩图分析生成的10个miRNA的详细列表。使用了这10个候选物通过 logistic回归和GMM分析来验证miRNA，根据肿瘤复发的AUC值建立了8-miRNA标记。由于8-miRNA标记可能是预后的生物标志物，因此对GSE40049和GSE19783进行了独立研究，以验证其预测准确性。根据预测结果确定需要积极治疗以提高生存率的TNBC患者高危人群。
对于TCGA_TNBC和GEOD-40525数据集， hsa-miR-486-5p，hsa-miR-139-5p和hsa-miR-10b-5p的表达水平下调，hsa-miR-107，hsa-miR-146b-5p，hsa的表达水平-miR-142-3p，hsa-miR-17-5p，hsa-miR-455-3p，hsa-miR-324-5p和hsa-miR-20a-5p在TCGA_TNBC和GEOD-40525数据集中均被上调。比较肿瘤与相邻正常组之间10种候选miRNA的表达水平，发现TCGA_TNBC和GEOD-40525数据集的差异具有统计学意义。基于以上观察，又通过ROC分析评估了10种miRNA的特异性和敏感性，发现这10种miRNA与先前研究的几种癌症有关。
图2.10个候选miRNA在TNBC样品中异常表达
根据TCGA_TNBC数据，与TNBC患者相比，非TNBC患者中10个候选基因的表达显着。3个下调的miRNA中只有hsa-miR-486-5p不显着。hsa-miR-20-5p，hsa-miR-107，hsa-miR-146b-5p，hsa-miR-455-3p，hsa-miR-324-5p，hsa-miR-17-5p，hsa-miR -142-3p在TNBC与非TNBC患者之间的7种上调的miRNA中极为显着。结果表明，这10种候选miRNA在TNBC和非TNBC患者样品中有很大差异。
图3.比较TNBC和非TNBC中的10种候选miRNA
这些结果表明，在个别研究中（TCGA_TNBC和GEOD-40525），异常表达的miRNA的表达水平是一致的。因此，这10种miRNA候选物有希望成为TNBC患者的复发预测参数。
2 训练集用于TNBC复发预测的8-miRNA验证
为了实施预测模型，使用 logistic回归分析来评估10个miRNA候选物的每一个的表达值与患者DFS分析中筛选的AUC值之间的关联。来自10个miRNA候选物的 logistic回归模型中共有1023个公式。使用GMM进行聚类是一种非常可行的方法，并具有良好的集群性能。作者在提出的算法中通过GMM和AUC将基因集聚为八个聚类，之后选择了具有最高AUC的八个簇之一来预测TNBC患者的复发。通过整合8个miRNA的表达数据，开发了复发miRNA候选风险评分模型。hsa-miR-139-5p，hsa-miR-107，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-10b-5p，hsa-miR-146b-5p，hsa-miR-455-3p，hsa-miR -20a-5p和hsa-miR-324-5p验证显示GMM分类器在1023个公式之一中的平均准确度为0.8031，如图4A。
图4 .基于高斯有限混合的AUC和logistic回归模型
此外，作者通过ROC测试得到区分TCGA_TNBC数据集中的复发患者和非复发患者的miRNA以及8-miRNA和7-miRNA特征的准确性。还使用该模型预测和比较luminalA（AUC = 0.7;绿色），luminalB（AUC = 0.83;蓝色），HER2（AUC = 0.94;红色）和TNBC（AUC = 0.8;紫色）的AUC值亚型。结果表明，HER2，luminal B和TNBC患者中这10个候选者的AUC值在预测复发方面优于luminal A患者。但是，TNBC中8-miRNA组合的AUC值被限制为0.8，并且小于其他亚型。
为了验证8-miRNA预后作用，miRNA风险评分的计算方法如下：组合miRNA=（0.02554×miR-139的表达值）+（-0.000005284×miR-10b的表达值）+（ 0.0003305×miR-486的表达值+（0.008664×miR-107的表达值）+（0.003201×miR-324的表达值）+（0.001031×miR-455的表达值）+（0.0004741×miR-455的表达值miR-146b）+（-0.001575×miR-20a的表达值）。通过将风险评分按照其中位数（中位数= 1.602）进行划分，将111例患者分为高危（n = 55）和低危（n = 56）组（6例患者中没有OS或DFS数据）。
图5.在111例TNBC患者中8-miRNA信号的预测价值
此外，对患者的DFS和OS，使用8-miRNA信号的Kaplan-Meier生存分析来比较高危组和低危组。在分析中确认高风险组的复发和死亡率显着高于低风险组，更重要的是，ROC曲线进一步证明了风险评分模型能够有效预测TNBC患者的复发。另外，8-miRNA的AUC值为0.8032。TNBC的8-miRNA功能作用涉及TNBC的生长，转移，化学抗性，免疫调节剂，复发和凋亡。这些结果进一步支持8-miRNA标记的组合显着改善预后价值，高风险组的患者复发和死亡的机率高于低风险组。
3 TNBC中miRNA预后的生存分析
为了进一步研究8种单独的miRNA与TNBC患者OS和DFS的临床特征之间的特异性联系，采用Kaplan-Meier方法进行了全面的生存分析。在分析中，结果表明三种miRNA（hsa-miR-455-3p，hsa-miR-107和hsa-miR-486-5p）与OS显着相关。
图6.8个miRNA影响TNBC患者的的OS表达
此外，DFS分析结果表明hsa-miR-139-5p与DFS显着相关。这些结果表明，hsa-miR-139-5p与TNBC患者的复发相关。然而，hsa-miR-455-3p，hsa-miR-107和hsa-miR-486-5p与OS相关。
图7.8个miRNA的表达估计的TNBC患者的无病生存期
为了探讨与TNM分类相关的主要预后因素，以肿瘤大小，淋巴结状态和远处转移为主要预后因素，在肿瘤I-II期（早期）和III-IV期中仅hsa-miR-139-5p显着表达。作者还发现hsa-miR-139-5p与淋巴结转移高度相关，并在远处转移高度表达。在TNBC的早期阶段，通过TCGA_TNBC数据集中包含风险评分的8-miRNA的分布以及合并的91例患者（I和II期）的复发状态，评估了8-miRNA特征。与具有低风险分数的患者相比，具有高风险分数的患者倾向于增加肿瘤复发。
图8 .以亚组中的8个miRNA表达差异除进行TNM分类
4 鉴定8-miRNA模型风险评分相关通路
为了全面研究miRNA及其功能之间的相互作用，在高风险组中进行了针对8-miRNA标记的GO和Hallmark通路分析。功能富集分析表明，8-miRNA标记在炎症，转移和代谢中富集。此外，来自GSEA的前10个带有Hallmark基因集的集显示，大多数途径和基因对于炎症调节至关重要，并且癌症转移与高风险评分有关。前10个GO通路基因集还与淋巴细胞激活，细胞粘附和质膜外侧相关。
图9 .TNBC 8-miRNA复发的预测因子富集分析网络
为进一步确认哪些生物功能与8-miRNA相关，将miRTarBase的miRNA靶标与8-miRNA候选物结合起来，以识别其潜在靶标。结果表明8-miRNA与白介素4和白介素13信号，细胞衰老，RUNX3的转录调控，MECP2的转录调控和氧化应激诱导的衰老相关。此外，对排名前25位的功能通路进行了排名，结果是产生的通路对于免疫系统，细胞应答，基因表达，癌症和信号转导至关重要。
这些结果表明8-miRNA信号参与的是炎症和癌症转移。这一发现可能是由于免疫逃逸促进了肿瘤的复发，因此，对于高风险评分的患者，其复发和死亡率要比低风险评分的患者高得多。因此将这种8-miRNA标记定义为TNBC的8-miRNA复发预测因子。
5 通过验证集验证TNBC预测复发的miRNA
为验证8-miRNA的预后作用，将测试获得的相同miRNA应用于独立队列中的其他60名TNBC患者，评估了验证队列GSE40049，GSE19783和E-MTAB-1989数据集中的表达（由复发事件和无复发事件组成）。使用相同的8-miRNA进行了 logistic回归分析，以诊断和预测患者复发的可能性。根据风险中位数（中位数= -1.9938），将24例患者分为GSE40049中的高风险（n = 11）和低风险（n = 13）组。此外，根据中位风险评分（中位数= -3371），在GSE19783中将18例患者分为高风险（n = 8）和低风险（n = 10）组。使用具有8-miRNA特征的Kaplan-Meier生存分析来比较高危和低危组患者的DFS。确认了高风险组中的8-miRNA与GSE40049，GSE19783和E-MTAB-1989数据集的患者复发率显着相关。
图10.测试中的8-miRNA对TNBC的预测价值
总之，验证集中的8-miRNA验证显示了显着改善的预后价值。与低风险组相比，高风险组的患者复发和死亡的几率更高。
三、小结
在这项研究中，作者从训练集TCGA_TNBC和GEOD-40525中鉴定出总共8个miRNA作为与TNBC患者肿瘤复发相关的标志，并进一步验证了这些发现在三个验证集GSE40049，GSE19783和E-MTAB-1989中是一致的。基于精确预测的TNBC患者复发的预后风险评分和当前的预后方案结果表明，该8-miRNA标记具有高风险评分的患者，其癌症复发率增加且存活率降低，可以准确识别TNBC患者的临床结局。
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