导语
今天给同学们分享一篇关于阿尔茨海默病的免疫浸润状况确定生物标志物的生信文章“Discovery and Validation of Key Biomarkers Based on Immune Infiltrates in Alzheimer’s Disease”，这篇文章于今年7月份发表在 Frontiers in Genetics 杂志上，影响因子为IF=4.599。作者在本研究中开发了预测阿尔茨海默病患者的诊断模型，为治疗AD提供了新的视角。
Discovery and Validation of Key Biomarkers Based on Immune Infiltrates in Alzheimer’s Disease
基于阿尔茨海默病免疫浸润的关键生物标志物的研究
1.Hub基因鉴定
作者从NCBI GEO公共数据库下载了GSE63061数据集。患者总数为273例（AD组139例，对照组134例）。为了探索AD的生物标志物，作者通过LASSO回归进行特征筛选。LASSO回归结果显示，18个基因在AD中被鉴定为特征基因。另一方面，作者使用SVM-RFE算法来评估AD中的特征基因。数据表明，从前100个基因和LASSO回归算法选择的特征基因的交集获得总共7个差异基因。差异基因被用于后续研究的核心基因（图1）。
图1.诊断生物标志物的选择和Hub基因的鉴定
2.AD相关免疫浸润分析
微环境由免疫细胞，炎症因子，细胞外基质和各种细胞组成，对临床治疗敏感性和疾病诊断具有重要影响。通过研究AD数据中免疫浸润与Hub基因之间的关系，进一步探讨了影响AD进展的核心基因的潜在分子机制。结果表明，AD组单核细胞，M0巨噬细胞和树突状细胞含量显着高于正常患者，而许多细胞含量低于正常患者，如T细胞，CD4记忆激活，T细胞CD4幼稚，嗜酸性粒细胞和NK细胞静息。免疫细胞之间的相互作用如图2所示。
图2.AD与正常对照之间免疫浸润的情况
3.Hub基因和免疫浸润之间的关系
为进一步探讨核心基因与免疫细胞的关系，结果表明ABCA2与幼稚B细胞呈正相关。此外，CREBRF与中性粒细胞，树突状细胞活化和肥大细胞静息呈正相关。CD72与T调节细胞（Tregs），T细胞CD4幼稚细胞和浆细胞呈正相关，但与树突状细胞活化，中性粒细胞和肥大细胞静息呈负相关。CETN2与T细胞，嗜酸性粒细胞和CD4记忆激活呈正相关。KCNG1与肥大细胞静息和中性粒细胞呈正相关，与T细胞CD8呈负相关。NDUFA2与幼稚的T细胞CD4呈正相关，与活化的树突状细胞，嗜中性粒细胞和静止的肥大细胞呈负相关（图3A–G）。作者接下来从TISIDB数据库中获得了这七个关键基因与不同免疫因子（包括免疫抑制因子，免疫刺激因子，趋化因子和受体）之间的相关性。构建了免疫因子与AD核心基因之间的相关关系图（图3H-K）。作者选择与hub基因相关的免疫因子（平均相关系数大于0.2），并利用String和Cytosscape构建了一个相互作用网络（图3L）。这些分析证实，关键基因与免疫细胞浸润有较强相关性，在免疫微环境中起着至关重要的作用。
图3.Hub基因与免疫细胞浸润之间的相关性
4.AD相关通路分析
作者进一步探索了七个核心基因中涉及的特定信号通路，并探讨了它们影响AD进展的潜在分子机制。GSEA结果显示，参与ABCA2高表达的通路是胆固醇代谢。同时，参与KCNG1高表达的通路是脂肪细胞因子信号通路。参与CETN2高表达的通路是氧化磷酸化和产热，都与能量代谢有关。提示这三个核心基因可能通过影响机体的新陈代谢参与AD的进展。同时，NDUFA2和RPL36AL的高表达与核糖体有关。这表明它们都可以通过调节核糖体的功能来影响AD的进展（图4）。每个途径之间的分子相互作用网络如图5所示。此外，为了进一步鉴定在AD中起关键作用的核心基因，作者根据蛋白质之间的功能相似性关系对核心基因进行排序。结果表明，基于AD中的GO相似性评分，RPL36AL，CETN2和ABCA2是TO3关键基因；他们的中位分数分别约为0.35,0.35和0.30。此外，其余的显着低于0.3（图6A，B）。使用图6C中的圆圈图指示七个Hub基因的相关性分析。此外，RPL36AL，CETN2，KCNG1和NDUFA2显示出紧密的正相关，但其余三个基因主要显示出彼此的负相关。
图4.Hub基因相关GO富集分析
图5.核心基因相关通路的分子调控机制
图6.GO相似性语序与Hub基因的共表达分析
5.Logistic回归建立疾病预测模型
通过使用逻辑回归算法构建预测模型。结果表明，由7个基因构建的预测模型具有较好的诊断性能，AUC曲线下面积值为0.845。作者进一步下载了数据集GSE85426进行外部验证。结果表明，该模型具有较强的稳定性，AUC值为0.839（图7）。
图7.ROC曲线
6.七个Hub基因的实验
作者接下来进行RT-PCR实验以检测AD和正常对照组中hub基因的相对表达水平。研究数据表明，与对照组相比，AD中ABCA2和NDUFA2的mRNA表达水平降低（p<0.05）。相反，CREBRF和CD72的结果相反（p＜0.05，CREBRF，p<0.01，CD72）。此外，AD组和对照组之间的CETN2，KCNG1和RPL36AL水平没有显着差异（图8）。这些鉴定的七个基因可能作为潜在的诊断和预后生物标志物。
图8.RT-PCR验证AD和正常对照之间的hub基因
小结
本研究通过LASSO回顾与SVM-RFE算法最终识别出7个Hub基因，并通过RT-PCR检测这些Hub基因的表达水平，通过logistic构建了预测模型并进行外部数据集验证。对非肿瘤预测模型以及核心基因筛选感兴趣的老师，欢迎扫码咨询。
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