凝集素层析

我们用去垢剂溶解了膜蛋白之后，紧跟着的一步就是用wheat germ aglutinin (WGA) agarose来部分纯化insulin receptor。WGA是凝集素（lectin）中的一种，而lectin指的是可以与糖基结合的蛋白质。现在常用来做蛋白质纯化的凝集素绝大部分是从植物中提取出来的。绝大部分膜蛋白的extracellular domain和分泌蛋白都有N-linked glycan的糖基修饰。根据这个性质，用固定有适当的凝集素的beads，比如WGA agarose或者ConA agarose可以部分提纯膜蛋白。注意，只能是部分提纯，凝集素层析并不能一步登天，让蛋白质比活力一下子提高上千倍，至多几十倍就已经很不错了。但尽管如此，凝集素层析是一种很好的办法，因为buffer条件非常温和，洗脱液是加了糖的buffer，透析什么的也方便，非常非常适合于和其他层析方法偶联起来用。 纯化膜蛋白用的最主要的两种凝集素是WGA和ConA。谈到这里，我先向大家介绍一下N-linked glycans。N-linked glycans是哺乳动物细胞中最常见的一种糖基修饰。这种糖基是加在膜蛋白的extracellular domain上面。如果膜蛋白有这个sequence，N-X-S/T，最前面的Asparagine多半被N-glycan修饰。N-glycan是一个oligosaccharide结构，好像一个分叉的树枝一样。膜蛋白的新生肽链在被翻译合成的同时会被直接塞入ER lumen，同时就会被加上一整个树枝状的N-glycan core。这个N-glycan加上去之后，并不是就大功告成了，而是要经历一系列“裁减”，有的糖基会被去掉，新的糖基又会被加上，这样最后的N-glycan structure往往是千奇百怪。 但是N-glycan的“主干”都是相似的。 Man代表Mannose甘露糖，而GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖胺。 保留在ER或者cis-Golgi的膜蛋白，N-glycan往往是high-mannose type。在这种N-glycan的末端有很多甘露糖（mannose）修饰。最适合于纯化这种蛋白的凝集素是ConA。ConA主要识别alpha-mannose、alpha-glucose和alpha-GlcNAc，所以可以用这三种糖溶液来做洗脱液。分泌出去的蛋白，或者已经到细胞表面的膜蛋白的N-glycan往往是complex type。这种complex type N-glycan的末端往往修饰有sialic acid（唾液酸，一种带负电的糖）和GlcNAc。而WGA主要识别GlcNAc和sialic acids，所以特别适合于纯化这种类型的蛋白，洗脱液可以用GlcNAc和sialic acid溶液。 最后需要指出来是，纯化一种特定蛋白，选择用什么凝集素是完全经验性的，需要提前测试才知道的。