从手工到自动化，核酸提取技术发生了哪些变化？

    

 嗨，小伙伴们

小石头又和大家见面啦~ 

相信各位NGS达人对手工提取核酸实验并不陌生

从手工到自动化，核酸提取如何实现又快又好？

干货满满，请搬好小板凳排排坐，我们开始来聊

 血液及石蜡包埋样本预处理 

• 样本预处理是为了去除杂质，从而有利于核酸的提取及纯化，提高测定的灵敏度、准确度以及精密度。目前血液和石蜡包埋样本预处理自动化实现程度如表1所示。

  表1 血液石蜡包埋样本预处理

 注：石蜡包埋样本可在自动化核酸提取仪器中选择相应温度模块实现消化、解交联自动化。

血液的预处理

血液分离原理基于密度梯度离心，分离后得到的血浆成分再通过裂解、结合、洗涤和洗脱得到我们所需的cfDNA（如图1）。

   

图1 血液离心示意图

手工进行血浆分离时，需要对不同样本进行编号、记录，不但操作繁琐而且容易出错，限制了处理大批量样本的效率。因此，血液分装系统的出现解决了手工分装速度缓慢、容易出错的问题（如表2）。

表2 血液分装系统性能特点

石蜡包埋样本的预处理                           

石蜡包埋样本预处理步骤包括：脱蜡、消化、解交联。为了消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须保证在不增加外源性PCR抑制因子和尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底脱蜡。

传统脱蜡方法：二甲苯脱蜡（如图2）。二甲苯是一种有毒的有机试剂，不仅容易造成核酸片段化，核酸得率低，而且对操作者的人身安全有一定的危害性。因此主流试剂盒大多数采用无毒裂解液的方法脱蜡，或者Covaris的超声乳化脱蜡（如图3），纳米级别的处理使得石蜡包埋样本彻底脱蜡和水化。

图2 二甲苯脱蜡基本流程

图3 基于AFA(adaptive focused acoustic，适应性聚焦超声)专利技术的Covaris系列仪器

一步法脱蜡试剂盒具体步骤（如图4），将含有环保脱蜡剂的裂解液加入到含有石蜡包埋样本的离心管中充分混合，在60°C和90°C各孵育1小时后管内混合液会分成油层和水层，脱蜡后的核酸会存在于水层中，分离水层和油层从而实现脱蜡过程。

图4 一步法脱蜡基本步骤

相较于传统的二甲苯脱蜡，一步法脱蜡在自动化上主要具备以下优势（如表3）。

表3 一步法脱蜡的优势

对比可知，一步法脱蜡因为脱蜡、裂解过程能同步加热进行，无需额外手动操作，所以更易整合到自动化仪器。

 核酸提取自动化

核酸提取自动化的优点在于保证了标准化和自动化的无缝衔接，使研究人员从繁重的手工样本处理流程中解放出来。

         应用范围广泛包括：

• 法医疑难样本的纯化。

• 从植物组织、土壤、粪便等疑难样本中纯化核酸。

• 应用于DNA，RNA 回收及病毒核酸纯化。

市面上核酸提取试剂方法主要是柱提法和磁珠法。这两种方法既可用于手工提取也可以用于自动化提取（如表4）。

表4 核酸提取自动化

柱提法

柱提法的原理：基于二氧化硅在高盐离子浓度，低PH的环境下对核酸具有吸附作用，再通过低盐高PH溶液将核酸进行洗脱（如图5）。

图5 硅胶膜吸附柱的工作原理

柱提法工作流程

图6 柱提法工作流程

柱提法技术优点

• 去除抑制物：乙醇、有机物等
• 灵活使用：离心、真空抽滤均可
• 简单稳定：裂解、结合、洗涤、洗脱四步，对操作要求低，重复性好
• 易于实现自动化
• 高效：95%以上的核酸得率

柱提法自动化核酸提取纯化仪

这里我们以市面上某品牌的全智能自动核酸纯化仪（如图7）为例，为大家介绍该类设备的特点。 

图7 全智能自动核酸纯化仪外观及内部结构

该设备基于柱提法（如图8）纯化样本中DNA、RNA和蛋白质，可全自动完成裂解、结合、洗涤和洗脱步骤，支持多种试剂盒以及自定义程序的自动化。

图8 QIAcube Miniprep 标准操作流程示意图

该设备具备高安全标准，内置紫外线灯防止交叉污染；数码功能可进行样本跟踪和运行前检查，以增加样本产出效率。这款全智能自动核酸纯化仪的主要特点及其优势（如表5）。

表5 全智能自动核酸纯化仪主要特点及优势

磁珠分离法

磁珠分离法原理：与柱提法类似，磁珠外有硅胶膜包被，同样基于二氧化硅在高盐离子浓度，低PH的环境下可以特异性地吸附核酸，再通过低盐高PH溶液将核酸进行洗脱（如图9）。

磁珠分离法工作流程

图9 磁珠分离法工作流程

磁珠分离法技术优点

• 灵活性：能够实现自动化、高通量操作，并且满足微量生物样本DNA提取的要求
• 快速简捷：操作简单、用时短，整个提取流程只有裂解、结合、洗涤、洗脱四步，短时间内即可完成
• 稳定性：灵敏度高、磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高
• 安全性：与有机试剂提取法相比，大大减少对操作人员的身体危害
• 价格低廉：可满足数据库建设对大批量样本提取的需求
  
  
  
  

磁珠分离法自动化核酸提取纯化仪

下面我们以市面上某品牌的磁棒式全自动核酸提取仪为例，采用动图的形式向大家更直观地介绍其操作工艺。

全自动载入样本，条形码跟踪，只需要进行程序设置即可，可选择紧急优先级别

安装好试剂后，选择程序，开始运行。

全自动加样本，转管，全自动条码阅读记录，全程追踪，释放双手。

该设备基于磁珠分离法原理，纯化样本中DNA、RNA和蛋白质，可全自动化处理样本转移、加热裂解、振荡、洗涤、核酸分子结合、洗脱全过程。

清晰的工作路线——裂解过程产物由传送带单向传送（如图10），减少枪头吸取裂解产物或洗脱产物时，在工作台面上方横跨试剂以及PCR板等耗材来回移动的情况。

图10 全自动核酸提仪内部结构示意图

这款全自动核酸提取仪整合了硅胶膜纯化的速度、效率，以及磁珠纯化的便利性。独立分区工作台，同时结合了AS体系构建系统，实现了整个流程的自动化。

综上所述，随着临床分子诊断技术的标准化，以及它对核酸提取质量要求的提高，势必会推动核酸提取自动化技术的飞速发展，临床实验室实现全自动化也一定是未来的发展趋势。

参考资料来源：