靶向测序的目标区域怎么“抓”？要抓就要抓得又准又全！

前   言：靶向测序的优势

高通量测序技术的诞生和发展促进了人们在基因水平对致病机理、药物研究等领域的认识。目前，全基因组测序（Whole Genome Sequencing）、全外显子组测序（Whole Exome Sequencing）以及靶向测序（Target Sequencing）是应用较为广泛的DNA测序技术。

全基因组测序获得的海量数据中已经有明确应用价值的信息有限，因此更适合应用于科研领域。而全外显子组测序在对测序深度要求较低的遗传疾病领域应用广泛。全外显子测序在原理上也是靶向测序，不过目标区域则是人类基因组的全部外显子，对于低频体细胞突变检测因其测序成本较高而不适合使用。

相对于全基因组以及全外显子组测序，靶向测序可以进一步缩小目标区域范围且兼顾临床实际检测需求，既能根据患者所需提供多样化的基因panel，又能满足低频体细胞检出的测序深度，因此患者花更少的钱却可以获得与临床诊疗更紧密相关的信息。

靶向抓取的核心秘密

靶向测序是利用多重PCR扩增或探针杂交捕获的方法对目标基因区域进行富集和捕获，并基于高通量测序的一种技术手段。

多重PCR扩增

多重PCR扩增也称作扩增子测序（Amplicon-based)，是在传统PCR原理的基础上进行改进，即预先设计一系列针对目标区域的特异性引物，对DNA模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段，从而实现靶区域的富集。

图1：Ion AmpliSeq 的技术流程[1]

     也就是说，多重PCR的技术可以在一个或多个反应体系中实现大量特异性引物与目标区域进行互补结合，进而对目标区域进行PCR扩增，获得目标区域的扩增子。在实验操作的过程中，使用多重PCR技术，无需打断仪进行DNA片段化过程且DNA的投入量较低[2]。同时，相对于探针杂交的方法，多重PCR无需杂交等待时间，检测周期较短。

然而，多重PCR能够扩增的目标区域有限，引物设计以及后续优化过程难度大。在引物结合的过程中，SNP位点会对引物结合效率产生一定影响。在扩增过程中，错误碱基会被引入，尤其是在扩增循环数较多的情况下，增加假阳性结果的风险。同时，由于引物扩增效率存在差异，无法基于测序深度来检测CNV[2]。

探针杂交捕获

探针杂交捕获法（Hybridization-based)根据核酸分子的碱基互补配对原则，预先设计与目标区域互补配对的一系列探针，通过杂交反应，实现目标区域的富集。杂交捕获根据探针的状态不同分为固相杂交和液相杂交。目前液相杂交被更为广泛的用于靶向文库的构建过程中：携带生物素的探针与靶区域互补杂交后，再使用链霉亲合素修饰的磁珠进行探针捕获，从而实现目标序列与非目标序列的分离。

  图2：液相杂交捕获的技术流程[1]

相对于多重PCR的方法，杂交捕获方法的探针设计更加灵活，不会受到目标区域大小的限制，也可以尽可能减少扩增过程，保证了较高的文库复杂度。对于融合基因的检测，杂交捕获的方法更具优势，可以获得一些未知的融合亚型。同时，文库的均一性更佳，可以基于测序深度检测CNV。但在杂交捕获过程中，操作相对复杂，对人员要求较高；杂交过程消耗的时间久，检测周期相应延长。

*划重点：优秀的探针长什么样子？

探针一般为长度120 mer的RNA序列。相比于DNA探针，RNA探针有更好的亲和力，过量的 RNA 探针可以促使反应向杂交的方向进行，并减少文库片段的用量，并且RNA探针自身不会退火，所以能同时对大量目标片段进行捕获[3]。

同时，RNA特有的韧性加上120mer的的长度能确保特异性的同时有更好的“容错性”，在捕获含有SNV和InDel的目标片段时更具优势[4]。

表1. 多重PCR和杂交捕获方法的比较

	多重PCR	杂交捕获
优 势	1.操作相对简单，对实验的设备、人员的要求相对较低。 2.文库样本制备时间更短，缩短检测周期。 3.相对更少的DNA样本投入量。	1. 可覆盖的目标区域更广。 2. 可以检测基因的结构变异（例如融合基因） 3. 文库的复杂度较高。 4. 目标区域覆盖均一性更好。
不 足	1. 扩增过程中引入的错误碱基导致假阳性结果。 2. 富集的目标区域有限。 3. SNPs存在影响引物结合以及目标区域扩增的风险。 4. 不同引物扩增效率的差异影响文库均一性，会对CNV的检测造成较大影响。	流程相对复杂，检测周期长

如何评估靶向测序的数据质量

目标区域覆盖度

目标区域被reads覆盖到的比例。往往该值随着测序深度要求的增加而减小。

捕获效率

覆盖到目标区域的数据量与总数据量的比例（如图3，图4）。捕获效率越高说明数据的利用率越高，反之，存在大量无用数据，造成测序成本的浪费。

图3：捕获效率70%

图4：捕获效率50%

均一性

考量reads在每个区域的覆盖深度的差异。从图5发现，2种基于杂交捕获方法的文库均一性会优于基于多重PCR构建的文库。reads一般在GC含量较高（70%-80%）或者较低（30-40%）的覆盖深度低，在GC含量均衡（50-60%）的区域覆盖深度最高。（如图6）

图5：均一性比较[1]

图6：GC含量和覆盖度

如何提高靶向测序的数据质量

     做好接头封闭

      杂交过程中，对重复序列区域以及接头进行封闭，防止文库之间的互相结合导致非特异性杂交（如图7）。

图7：重复序列和接头封闭

控制杂交温度

严格控制捕获洗涤的温度，温度下降直接影响捕获效率，甚至文库均一性。

选用超声打断处理DNA片段

为了保证文库的均一性，DNA片段化尽量选用物理超声打断，可以产生随机的DNA片段。同时，尽可能减少文库构建过程中的扩增循环数，避免PCR引起的偏好。

【参考文献】

[1] Samorodnitsky E, Jewell B M, Hagopian R, et al. Evaluation of Hybridization Capture Versus Amplicon‐Based Methods for Whole‐Exome Sequencing[J]. Human Mutation, 2015, 36(9):903-914.

[2] Ballester L Y, Luthra R, Kanagalshamanna R, et al. Advances in clinical next-generation sequencing: target enrichment and sequencing technologies[J]. Expert Review of Molecular Diagnostics, 2015, 16(3):357.

[3] Gnirke A, Melnikov A, Maguire J, et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing[J]. Nature Biotechnology, 2009, 27(2):182-9.

[4] Meienberg J ,  Zerjavic K ,  Keller I , et al. New insights into the performance of human whole-exome capture platforms[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(11):e76-e76.