2021年4月12日，由美国FDA 领导的基因芯片/测序质控（MicroArray/Sequencing Quality Control，MAQC）协会在SEQC2项目中的循环肿瘤DNA（ctDNA）靶向测序研究在线发表于Nature Biotechnology（IF=36.558）：Evaluating the analytical validity of circulating tumor DNA sequencing assays for precision oncology。
SEQC2是MAQC协会在全球开展的基于二代基因测序（Next Generation Sequencing, NGS）技术的分析性能评估验证项目，在该项目中，协会对全外显子组测序，肿瘤DNA/RNA靶向测序，以及甲基化测序等多个领域进行了多家试剂盒厂商和实验室的跨平台分析性能验证，旨在建立行业标准，提供技术指南。项目为所有参与机构设置了严格的操作流程, 最终分析结果由项目PI根据金标准进行统一评估。本次Nature子刊发布的ctDNA检测相关结果纳入了包含燃石医学在内的5家全球领先肿瘤靶向NGS检测试剂盒厂商的液体活检产品。
图1. 参与SEQC2的液体活检产品（Supplementary Table 3）
项目结果显示，燃石朗清®168基因panel（图中绿色BRP）在检测灵敏度、特异性、准确性、可重复性和稳定性等方面均有优异表现。
Part 1
SEQC2：FDA MAQC为二代基因测序技术的临床应用标准和质量管理措施制定所设置的全球考题
MAQC协会缘起于2000年伊始，彼时微阵列基因芯片（Microarray）作为一种新兴的技术逐渐成为基因组学的核心技术之一，但尚无相关质控管理标准。为保证在监管范围内的正确应用，FDA MAQC协会于2005年便开启了相关的质控项目。
随着技术的推进，NGS技术近年开始成为肿瘤临床实践的常规手段。MAQC协会于2018年开始的第四阶段（MAQC4）正是为了开发适用于NGS的标准分析协议和质控标准，以增强科学研究和精准医学监管，MAQC4也被称为Sequencing Quality Control Phase 2，即SEQC2。
SEQC2多实验室、跨平台性能验证考题介绍（液体活检部分）
图2. 实验流程设计逻辑示意图（Figure 3a&b）
1. 实验样本的准备：为模拟真实世界的癌症样本和等位基因变异频率（variant allele frequencies，VAF）范围，研究人员利用10个已知癌症细胞系的基因组信息在癌症基因的外显子区域内构建了一组约40000个“已知阳性突变位点”和约10.2 Mb的“已知阴性位点”的混合样本，并基于此创建了不同VAF梯度的样本，如VAF 0.1-0.5%、0.5-2.5%，>2.5%；对该样本进行了酶切后选择大小约160-180bp的DNA片段模拟血液中ctDNA片段长度；
2. 实验样本发放给各家试剂盒生产商，并由生产商在美国、英国、中国和澳大利亚等地的13个实验室进行单盲检测，每个实验室使用5个液体活检panel中的一个或者多个测序分析，分析结果则统一递交至FDA进行汇总，最终评估panel检测灵敏度、特异性、准确性、可重复性和稳定性等临床实践核心指标。
Part 2
燃石医学综合表现国际一流,SEQC2指出辨别优秀液体活检技术的关键性能指标
SEQC2考题已经揭晓了“答案”，这些答案为临床辨别优秀的液体活检检测产品提供了方法指导，为大家整理如下：
01
液体活检中，只要测序深度足够深，就能测得足够准吗？
ctDNA中包括大量低丰度基因变异，低丰度突变的准确检出一直是液体活检临床应用的最大瓶颈，这也使得“panel测序深度是多少”成为临床专家关注液体活检技术时高频提及的问题。但SEQC2项目的结果明确地告诉我们，当建库技术能力受限时，“测得深”不能带来“测得准”，只有当建库技术提升了灵敏度的天花板，测序深度才能带来更准确的结果。
在SEQC2项目呈现的数据中，两个参数揭示了不同建库技术之间的能力差别，一是“有效片段回收率”，它体现了在同样一管血中，经过重重的信号采集和处理后，有多少有效的细胞游离DNA（cell free DNA，cfDNA）片段被保留下来用于分析，这一能力直接决定ctDNA检出的可能性。
图3 25ng投入量下有效片段回收率（Figure 3c）
二是“panel覆盖均一性”，在同样都是25ng的DNA投入量的情况下（相当于7500个基因组拷贝），SEQC2比较了不同panel测序深度对目标设计区域覆盖率的差异，更好的覆盖均一性可以保障即使困难区域也能得到良好的覆盖，从而提升检测的灵敏度。
图4. 液体活检panel覆盖均一性评估（Figure S3a）
而在这两个参数上，燃石朗清®（图中绿色BRP）都展现了最好的表现，这也解释了为什么在原始测序深度并不突出的情况下，燃石朗清®却做到了最高之一的灵敏度。
02
灵敏度和假阳性率难两全，产品可以经受灵敏度和假阳性率双重考验吗？
在临床实践过程中，液体活检panel的性能指标中灵敏度和假阳性率（特异性）往往最受关注。高灵敏度的液体活检是对低频突变不漏检的保障，同时低假阳性率则帮助患者抓住真正获益的治疗机会，避免了治疗费用和宝贵的治疗时间窗口的浪费，技术上的相互“制衡”似乎造成了灵敏度和假阳性率难两全的局面。兼顾灵敏度和假阳性率也成为了检测机构保障液体活检结果准确性必须要攻克的难题。
SEQC2通过对每个文库目标区域已知变异的检出结果分析，来评估基于杂交捕获法的ctDNA检测灵敏度。在高频突变中，所有panel都表现出了极高的灵敏度，再次佐证了样本中ctDNA含量对检测结果的重要影响。但在VAF到达0.5%以下的“挑战区”时，不同panel的表现开始呈现显著的差异。其中，低VAF突变中燃石朗清®（图中绿色BRP）成为灵敏度最佳的NGS液体活检panel之一：在VAF为0.3-0.5%时，灵敏度>90%。
图5. 不同VAF对ctDNA检测灵敏度的性能评估（Figure 4a）
而在保证高灵敏度的同时，如何保持低假阳性率，来确保结果的准确性？参与SEQC2的所有panel分析均使用独特的分子标识符（Unique Molecular Identifiers，UMIs）来纠正测序错误，假阳性率相对较低。考虑panel大小后，在25 ng DNA投入量下，燃石朗清®的假阳性率最低（0.03 FP/kb），错误的变异几乎完全发生在VAF<0.5%的区域。综合灵敏度与特异性的整体评估，NGS液体活检panel中燃石朗清®准确性最佳。
图6. 25ng DNA投入量时，不同panel 假阳性率表现(Supplementary Table 5)
图7. 25ng DNA投入量时，燃石朗清®（图中绿色BRP）的准确性最佳（Figure 4b）
03
中心实验室的检测能力是否可以在院端复现？
“中心实验室的检测结果，在同样的测序平台、实验方法和分析方法下，可以在院内实验室复现吗？”这可能是临床医生和院内检测科室都会关注的问题。
SEQC2评估了同样的样本在实验室内和实验室间的检测结果可重复性，数据显示，同一panel在同一实验室内不同批次之间和不同实验室不同批次之间的可重复性是相似的。这意味着这些参与SEQC2研究的NGS panel试剂盒的检测性能和生信分析具有较强的稳定性，结果的波动性来自随机而非系统性的室间差异。
图8. 实验结果可重复性评估（Figure 4c&4d）
同时，所有panel都在中高频变异（VAF 0.5-2.5%、VAF>2.5%）中呈现了较高的可重复性，但在低频变异（VAF 0.1-0.5%）的可重复性有所下降，这也提示了临床实践中ctDNA 低频变异为液体活检带来的挑战。综合所有实验室内和实验室间的差异性评估，燃石朗清®（图中绿色BRP）的分析性能可重复性同样表现最佳。
04
难上加难：当cfDNA总量极低的时候，液体活检表现如何？
在NGS的真实应用场景里，患者血液样本中提取的cfDNA含量通常很少，尤其是当液体活检应用于早期肿瘤患者时。燃石医学内部数据显示，从一管外周血（8-10ml）中，约15-20%的肿瘤患者提取到的cfDNA总量不足25ng，因此，低投入量情况下液体活检的技术能力也值得格外关注。
SEQC2考题中，测量了高（50 ng）、中（25 ng）和低（10 ng）DNA投入量时每个杂交捕获panel分析的性能。在最低10 ng DNA投入量时，燃石朗清®的灵敏度可重复性均表现最佳，这确保了在真实临床场景的应用中对“困难样本”检测能力的稳定表现。
图9. 不同DNA投入量时对panel性能的综合考量（Figure 5）
NGS技术的诞生使得肿瘤患者一次检测所有靶向用药的机会成为可能，而液体活检技术的发展则拓宽了肿瘤NGS应用的场景和人群范围，将可以从精准医疗中获益的患者从晚期逐步推进到早期，同时可以帮助医生进行患者治疗的全程管理。但液体活检质量的评估标准对医生和患者来说，仿佛一直是一种看不见、摸不着的东西。
SEQC2项目首次通过单盲的评估实验，提供了一个直观、客观、全面、且定量地感受技术高低的机会，从而给出标准和依据帮助医生判断什么是高质量的液体活检产品，以及目前液体活检的技术边界在哪里。
燃石朗清®在SEQC2液体活检项目中呈现了傲人的性能，这凝聚了燃石医学在技术研发与质量管理上多年的耕耘和坚持，我们为之深感自豪，也期待这样的成绩为中国NGS行业建立更多的信心和信念。燃石医学将始终携手临床专家、协会和管理机构，坚定地推动NGS行业在中国的规范化进程，最终能够获益肿瘤患者。
关于燃石医学
燃石医学（纳斯达克代码：BNR）成立于2014年，公司使命为“用科学守护生命之光”，专注于为肿瘤精准医疗提供具有临床价值的二代基因测序（NGS）。公司业务及研发方向主要覆盖：1）基于NGS的肿瘤患病人群检测，累计检测样本超过27万例，在中国拥有领先的市场份额；2）基于NGS的癌症早检，目前已经进入产品验证阶段。燃石医学于2018年7月获国家药品监督管理局（NMPA）颁发的中国肿瘤NGS检测试剂盒第一证，在体外诊断领域具有里程碑式意义。实验室获得广东省临检中心颁发的“高通量测序实验室”技术审核，以及美国CLIA和CAP实验室质量体系资质认证。公司将继续致力于开发创新可靠的NGS检测产品，推动肿瘤精准医疗领域的发展。
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