EbioMed: 黑色素瘤单基因甲基化思路

Molecular, clinicopathological, and immune correlates of LAG3 promoter DNA methylation in melanoma

黑色素瘤中LAG3启动子的分子，临床病理和免疫相关性与DNA甲基化的关系

一、研究背景

随着免疫检查点封锁(ICB)的出现，癌症的免疫治疗已成为晚期癌症治疗的主要支柱。为了克服甚至防止其治疗抗性，将另外的免疫检查点抑制受体评估为免疫治疗的靶标。共受体淋巴细胞激活基因3(LAG3，LAG-3，CD223)是免疫检查点抑制免疫疗法的一个有吸引力的新靶标。LAG3表达与更好的总体生存率有关。但到目前为止，对LAG3的表观遗传调控知之甚少，同时，关于黑色素瘤及其微环境中LAG3 DNA甲基化的生物学和临床意义了解甚少。

二、研究思路

三、结果解析

1、LAG3 mRNA表达与甲基化的相关性

通常启动子甲基化会使转录基因沉默。将LAG3基因内16个CpG位点的甲基化水平与TCGA中468例黑色素瘤样本的RNA-Seq表达数据关联起来以验证LAG3的表达是受DNA甲基化控制的假说。使用Infinium HumanMethylation450 BeadChip来分析LAG3基因的甲基化。

图1. LAG3的甲基化位点和基因结构概述

在通过Human Methylation450 BeadChip磁珠靶向的16个不同基因座上确定了LAG3甲基化。图1显示的是12号染色体，位置6,771,547-6,779,861，包括LAG3基因，其转录本和调控元件(启动子，启动子侧翼和CTCF结合位点)，研究的序列。说明在LAG3基因的基因结构中，有两个蛋白质编码转录本LAG3-201和LAG3-202具有相同的转录起始位点。

在转录起始位点的区域预测了extended promoter和它的侧翼的位置。CpG位点3至12位于启动子中。磁珠1和2探测到的CpG位点位于上游启动子侧翼，包括一个promoter-embedded的CTCF结合位点。CpG位点13和14位于基因体内。CpG位点15和16位于下游CTCF结合位点。

在16个分析的磁珠中，有12个LAG3甲基化与基因表达之间呈显著负相关(表1)。黑色素瘤组织中的甲基化水平和mRNA表达之间的负相关性，在第8珠靶向的CpG位点最明显，其被显示在图2A。

表1.LAG3甲基化与LAG3 mRNA表达，淋巴细胞评分和总生存率的相关性

有趣的是，LAG3甲基化与基因表达之间呈显著负相关的11个CpG位点位于启动子和上游启动子侧翼中(磁珠1至11)。相反，位于基因体中的磁珠14和与CTCF结合位点结合的磁珠15呈现显著正相关。磁珠15在图2B中显示。

图2. 468例黑色素瘤样品中LAG3甲基化与mRNA表达的相关性

2、LAG3甲基化和mRNA表达与免疫细胞浸润的相关性

已知LAG3可作为在白细胞上表达的抑制性检查点受体，假设LAG3的表达与肿瘤浸润免疫细胞的水平相关。根据这个假设，研究了TCGA队列中LAG3甲基化和mRNA表达与淋巴细胞评分和白细胞分数的相关性。如预期，LAG3 mRNA表达与淋巴细胞评分和白细胞分数之间存在显著的正相关(表1，图3)。因此，以磁珠1至13为靶标的CpG位点主要位于启动子区域，淋巴细胞评分和白细胞分数与LAG3甲基化呈显著负相关。进一步研究有关样品肿瘤含量的TCGA数据。在这里，LAG3 mRNA表达和甲基化模式与TILs中观察到的模式相反：肿瘤组织的纯度和肿瘤细胞含量(占肿瘤细胞核的百分比)与LAG3 mRNA表达呈显著负相关。因此，肿瘤组织的纯度和肿瘤细胞含量与磁珠1至13靶向的CpGs(肿瘤组织的纯度)和磁珠1至12靶向的CpGs的LAG3甲基化显著相关(图3)。靶向位于基因体内的CpG位点的磁珠14和CTCF结合位点的CpG的磁珠15，显示LAG3甲基化与肿瘤组织的肿瘤细胞含量/纯度之间呈负相关。同时，检测到LAG3甲基化与白细胞分数和淋巴细胞评分显著正相关。综上，证明了珠1-13靶向的低甲基化区域与LAG3 mRNA表达的增加有关。磁珠1至12靶向的高甲基化区域与肿瘤细胞含量和纯度相关，磁珠14和15靶向的高甲基化区域与淋巴细胞分数和白细胞分数相关。

为了根据TCGA数据跟踪结果，建立了一个由120例黑色素瘤样本(UHB队列)组成的验证队列。随后使用针对CpG位点8和4的qMSP测定法(图1)，以显示在TCGA队列分析中高度显著的相关性将甲基化水平与淋巴细胞评分关联起来，使用组织病理学检查进行评估。同时，还分别在使用qMSP assay 4的114例和使用qMSP assay 8的117例黑色素瘤样品获得甲基化和组织病理学分析的有效结果。观察到8珠(qMSP assay 8)靶向的CpG位点的甲基化与淋巴细胞评分和白细胞分数之间存在显著的负相关。因此，不仅证明了CpG位点8的甲基化与肿瘤细胞分数之间呈正相关，CpG位点4的甲基化(qMSP assay 4)与淋巴细胞得分和白细胞分数之间显著负相关，也证实了从TCGA数据获得的结果。

图3. LAG3甲基化和mRNA表达与免疫细胞浸润的相关性 显示了LAG3甲基化与mRNA表达与白细胞分数和不同免疫细胞浸润特征之间Spearman的r相关系数。

3、LAG3甲基化和mRNA表达与免疫细胞亚群的相关性

肿瘤组织由不同的成分组成，包括肿瘤细胞，基质和不同的免疫细胞亚群将B细胞，CD4+和CD8+T细胞，嗜中性粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞的RNA-Seq signatures与LAG3甲基化水平相关联(图3)。初步结果显示，LAG3启动子低甲基化与肿瘤浸润免疫细胞水平的升高相关，而免疫细胞的浸润与下游CTCF结合位点的高甲基化相关对单个免疫细胞亚群的分析证实了LAG3启动子低甲基化和LAG3 mRNA水平与促炎和活化的免疫细胞亚群之间存在显著相关性，尤其是活化的NK细胞，CD8 +T细胞和活化的CD4+记忆细胞，这与已发表的关于活化免疫细胞上LAG3表达的结果一致：LAG3在活化的免疫细胞上的表达。

LAG3启动子的低甲基化和mRNA表达与Tregs的RNA-seq signature相关。Tregs已被证明在动态水平表达LAG3取决于激活状态，并且具有黑色素瘤中描述的高水平观察到促炎性M1巨噬细胞和静息DC的LAG3 mRNA表达与启动子低甲基化以及RNA-seq signature呈正相关。

LAG3启动子高甲基化与静息NK细胞，幼稚CD4+T细胞，M0和抗炎性M2巨噬细胞以及活化的DC的RNASeq signature 相关。这种发现是有趣的，因为对于LAG3在浆细胞样DC中的作用知之甚少。与之前的结果一致，CpG 15和16靶向的CTCF结合位点的高甲基化显示出相反的模式，并与促炎或活化白细胞亚群的RNA-Seq signature 相关，而CTCF结合位点的低甲基化与抗炎，未分化和主要静息免疫细胞亚群的RNA signatures 相关(图3)。

4、外周血细胞，黑色素细胞和黑色素瘤细胞系亚群中的LAG3甲基化

在下一步中，研究了黑色素细胞和黑色素瘤细胞系以及包括淋巴细胞和单核细胞在内的单个的外周血单核细胞(PBMC)中的LAG3甲基化。与先前的结果一致，整个肿瘤组织中LAG3 mRNA表达与淋巴细胞评分之间显著相关以及LAG3启动子甲基化与淋巴细胞评分之间呈负相关(表1)，分离的PBMCs在CpG位点3至7和11处有明显的LAG3低甲基化，它们都位于启动子区域(图4)。黑色素瘤细胞系在LAG3启动子区域高甲基化。该结果与TCGA数据分析中证明的相关性相符，显示了由磁珠1至12靶向区域中的高甲基化与肿瘤细胞含量和纯度相关。黑色素细胞中的甲基化模式类似于在黑色素瘤细胞中观察到的模式，并且在CpG位点1至9中显示出高水平的甲基化。但是，在甲基化模式中观察到的变异性较大。与黑色素瘤细胞相比，CpG位点11、14和15显示出较低的甲基化水平。CpG位点16仅显示了淋巴细胞评分与LAG3甲基化之间相关性的趋势。因此，黑素瘤细胞和免疫细胞之间的甲基化之间只有少量但显著的差异(图4)。

图4. 白细胞，黑素细胞和黑素瘤细胞系中的LAG3甲基化

5、LAG3甲基化与干扰素-γ signature的相关性

关于LAG3作为参与免疫应答的抑制受体的功能，分析了LAG3的mRNA表达和甲基化与由IFN-γ(IFNG)和IFN-γ调节基因(STAT1，STAT2，JAK2和IRF9；表2)的相关性。如预期，LAG3 mRNA表达与INF-γ signature显著相关。与先前的发现一致，启动子区域中的LAG3甲基化与INF-γ signature呈负相关，而与位于珠14和15靶向的基因体和CTCF结合位点的CpG位点则显示出显著的正相关。

表2.LAG3甲基化和mRNA表达与IFN-γ signature 的相关性

6、肿瘤细胞内源性LAG3 mRNA表达依赖于药理脱甲基和干扰素-γ刺激

对黑色素瘤中LAG3的肿瘤细胞内源性mRNA表达及其转录组调控了解甚少。因此，研究了黑色素瘤细胞系A375中LAG3 mRNA的表达以及次甲基化剂5-氮杂胞苷对LAG3的影响。实验包括四个不同的治疗组：1.不治疗，2. IFN-γ，3.  5-氮胞苷，4. IFN-γ和5-氮胞苷(图5A和图5B)。实验进行了9次，实验1有6次重复(1.1-1.6)和3个独立实验(2-4)使用qMSP量化了8珠靶向的启动子CpG位点的启动子甲基化水平。

如预期，经5-氮杂胞苷处理的细胞系中的甲基化水平显著低于未经5-氮杂胞苷处理的组中的甲基化水平(图5B)。IFN-γ治疗对甲基化水平没有显著影响。在下一步中，通过qRT-PCR定量了LAG3 mRNA水平。与的预期相反，对照组中没有5-氮杂胞苷的单独IFN-γ刺激导致LAG3 mRNA表达显著下降(图5A)。然而，5-氮杂胞苷处理导致LAG3表达显著增加。有趣的是，除5-氮胞苷处理外，IFN-γ刺激还导致LAG3 mRNA表达显著且急剧增加。

图5.药理学去甲基化和干扰素-g刺激诱导肿瘤细胞本征LAG3 mRNA表达

7、LAG3甲基化和mRNA表达与临床病理参数和分子特征的关系

根据TCGA队列数据分析了LAG3甲基化模式和mRNA表达与临床病理，流行病学和分子特征的可能相关性，以确定具有预后意义的参数。但并未发现LAG3 mRNA表达或甲基化与年龄或性别之间的显著相关性。分析LAG3 mRNA在不同肿瘤组织部位的表达表明，与原发性肿瘤和远处转移相比，LAG3 mRNA在区域淋巴结和皮肤转移中的表达更高。LAG3 mRNA表达在远处转移中最低。

这些表达上的差异也可以归因于不同的肿瘤细胞含量。因此，LAG3甲基化状态的差异取决于肿瘤部位。在从淋巴结获得的组织中，被2-12个磁珠靶向的CpG位点的平均启动子甲基化最低。磁珠14-16靶向的CpG位点的甲基化水平，包括LAG3基因的CTCF结合位点，在淋巴结和皮肤转移中最高，这可能归因于淋巴细胞浸润的增加。作者没有进行进一步的亚组分析以比较不同肿瘤部位内脏转移中的LAG3甲基化，因为TCGA数据中包含的单个亚组太小，无法进行有效的亚组分析。

8、 黑色素瘤中LAG3甲基化和mRNA表达的预后价值

在TCGA队列中测试了LAG3 mRNA表达和甲基化的预后意义。测试甲基化和mRNA表达水平并将他们作为连续变量，以避免由于引入了用于患者样品分类的阈值而导致拟合过度的模型。证明LAG3 mRNA表达的增加与黑色素瘤患者的总体生存率显著提高有关。根据该结果，发现分析的16个磁珠中有13个磁珠靶向的CpG位点的高甲基化与较差的结局相关，研究的4个磁珠中，结果具有统计学意义(表1)。

当进一步将mRNA表达和甲基化数据二分以优化阈值，Kaplan-Meier生存曲线证实了LAG3 mRNA表达较高的患者的生存率显著提高(图6)。该基因启动子区域(珠3、4、6、8、11、12)的CpG位点的甲基化状态的Kaplan-Meier生存图进一步证实作者的发现，即LAG3启动子低甲基化与更好的生存结果相关。相反，当表征磁珠14和15靶向的基因体中CpG位点和CTCF结合位点的甲基化时，发现这些CpG位点的高甲基化与黑色素瘤患者的更好生存结果相关(图6)。

图6.根据LAG3甲基化和mRNA表达分层的黑色素瘤患者OS的K-M分析

9、免疫检查点阻断治疗黑色素瘤患者LAG3甲基化与无进展生存的关系

进一步测试了LAG3甲基化作为ICB转移性黑色素瘤患者疾病进展的预测生物标志物。通过将qPCR靶向的CpG位点8和4测量的治疗前样品中的无进展生存期(PFS)与甲基化水平相关联。在单变量Cox比例分析中，发现LAG3高甲基化肿瘤患者PFS有缩短的趋势。当使用优化后的阈值进一步将甲基化数据二分时，Kaplan-Meier生存曲线表明患有低甲基化肿瘤的黑色素瘤患者的PFS更好(图7)。

图7.ICB治疗118例转移性黑色素瘤患者PFS的K-M分析，据LAG3甲基化分层小结

本篇文章主要是研究黑色素瘤中LAG3 DNA甲基化与基因表达，临床病理参数，分子和免疫相关性以及结局的关系。随后，测试了LAG3甲基化作为黑色素瘤对免疫检查点抑制反应的预后生物标志物和预测性生物标志物的性能。对该基因的表观遗传调控的深入了解可能为开发预测性生物标志物铺平道路，以鉴定潜在受益于LAG3拮抗剂治疗的患者。

编辑：邓慧

校审：林安琪 刘郁辰