上游技术 | 详解双特异性抗体的还原和片段化问题

内容概要

抗体生产过程中，片段化（Fragmentation）和（或）二硫键（Disulfide bond，DSB）还原是较为常见的现象，其主要由非酶环境因素和酶促反应所致。相比传统的单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAbs），双特异性抗体（Bispecific antibodies，BisAbs）的分子结构更为复杂，其中引入的额外结构域会加剧片段化和（或）DSB还原问题。此外，片段化和（或）DSB还原也会导致抗体聚集和增加产品的异质性，进而影响产品的免疫原性和药效特性。

因此，本文重点介绍了BisAb生产中的还原和片段化问题，并深入分析了导致该问题的原因：非酶因素和酶促反应。此外，还进一步分析了BisAb生产中的还原/重新氧化的动力学特征，以期探索缓解该问题的有效策略。

知识要点

1、BisAb为何易还原？结构特征，非酶因素，酶促反应；

2、BisAb如何被还原？还原动力学及其途径；

3、BisAb重新氧化有何后果？直接重新氧化和低pH处理后重新氧化的特征及产物。

双特异性抗体

BisAbs是一类新兴的生物治疗药物，其能结合两种不同的抗原表位。这种多价的抗原结合能力使得BisAbs药效更强，应用更为广泛，目前已应用于狼疮、类风湿性关节炎、骨质疏松、淋巴瘤、白血病等疾病的治疗。

BisAbs形式多样，已报道的BisAbs达100多种，每种都具有独特的抗原结合域组合。其中一类BisAb分子是将单链Fv（ scFv）片段结合至全长IgG重链上，即形成IgG‐ scFv融合蛋白（IgG‐ scFv Fusion）。额外的 scFv含有与抗原结合的VH和VL结构域，通常与甘氨酸/丝氨酸重复肽连接在一起，并且含有工程化的DSB以提高生化稳定性。

图1 双抗结构多样性 

图 2 IgG‐ scFv融合蛋白（IgG‐ scFv Fusion） 

BisAb的还原和片段化

虽然可以通过各种工程化手段提高BisAb的稳定性，但额外引入的 scFv片段仍会给BisAb的生产过程带来不少挑战。由于BisAb本质上也是一种mAbs，故一般mAb的不稳定性问题也会在BisAb上有所体现，而且该类问题已研究得较为透彻，其中主要的不稳定形式为聚集体和片段。除了与mAb生产中相似的稳定性挑战外（点击了解mAb的【还原】问题），由于BisAb分子自身的复杂性，也引入了一些BisAb独特的稳定性问题。例如：IgG‐scFv Fusion分子中，通过 scFv增加了额外的结构域， scFv在BisAb分子中的相对位置对分子的稳定性有重要的影响。而且，由于 scFv的VH和VL结构域之间的工程化DSB可能形成分子间DSB，进而形成单体或二聚体，导致BisAb的生物活性降低。此外，scFv在BisAb中的相对位置或分子间DSB也会导致分子构象和蛋白胶体变化，最终影响抗体的药代动力学和药效学特性。

表 1 BisAb分子（IgG‐ scFv Fusion）的不稳定性

非酶因素

蛋白质浓度、疏水性、离子强度、表面电荷、溶液pH值、辅料、搅拌、冻融和温度等工艺条件均会影响BisAb的稳定性。尽管蛋白质主链在生理条件下非常稳定，但在有某些氨基酸序列（反应性侧链）、溶剂条件（如：pH和温度）和杂质（如：金属和自由基）存在时，可能导致蛋白还原或断裂，因此蛋白质主链的柔韧性及反应性侧链可能对蛋白质稳定性产生不利影响。一般认为，mAb和BisAb上连接Fab和Fc的铰链区是分子中最柔韧的区域之一，该区域由上部（EPKSCDKTHT）、中部（CPPCP）和下部（APELLGP）组成。蛋白质中两种最常见的断裂机制是肽键水解和β-消除，上铰链区中的丝氨酸和AspLys键易于通过β-消除和肽键水解断裂。同样，若下铰链区域具有较大的柔韧性区域，或其溶剂暴露区域含有GlyGly键，则在酸性和碱性条件下也易于断裂。当一级序列中存在Asp、Gly、Ser、Thr、Cys或Asn残基时，抗体的断裂可能性会增加，因为所有这些残基（Gly除外）的侧链可通过特定机制促进断裂。除了铰链区断裂外，IgG-scFv Fusion的（Gly）4Ser连接区也容易断裂。

图 3 mAb和BisAb分子的易断裂位点 

酶促反应

一般情况下，上游收获操作期间的剪切力会导致细胞裂解，进而释放出胞内的还原酶，从而使BisAb被还原。

谷胱甘肽系统包括谷胱甘肽（Glutathione）、谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）和谷氧还蛋白(Glutaredoxin，Grx），存在于所有哺乳动物细胞中，参与多种细胞功能，包括抗氧化解毒、调节一氧化氮循环、DNA合成和修复相关代谢和生化反应、蛋白质合成、氨基酸运输、铁代谢、细胞周期调控等。硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白1（Thioredoxin 1，Trx1）、硫氧还蛋白还原酶1（Thioredoxin reductase 1，TrxR1）和 还原型辅酶Ⅱ（NADPH），该反应系统在许多还原反应中作为氢供体，特别是核苷二磷酸转化为相应的脱氧产物和光依赖性的还原反应中，其也以结构域的形式出现于二硫键异构酶中。此外，Trx1一般通过半胱氨酸硫醇-二硫键交换促进其它蛋白还原，从而起到抗氧化剂的作用。

谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统在抗体还原调控方面起着重要作用，但二者在细胞中广泛存在，而且其对细胞功能具有重要作用，所以很难避免。不过，抗体被还原后，在氧化性条件下片段可能可以重组成完整的抗体，而且生物活性无明显变化。然而，据研究，在抗体纯化过程的低pH病毒灭活步骤中，收获的细胞培养液还原的抗体可能会聚集，并引起患者非预期免疫反应或影响药物的疗效特性。因此，有必要考察BisAb对细胞还原酶的敏感性以及由此产生的杂质，并据此改善产品质量和提高工艺稳健性。

图 4 谷胱甘肽和硫氧还蛋白系统导致的抗体还原 

BisAb还原/重新氧化动力学

研究BisAb胞外/体外的还原和重新氧化可深入理解BisAb的氧化还原动力学，并据此探究缓解BisAb还原和片段化问题的策略。2020年，Swope等人通过硫氧还蛋白系统研究了BisAb（IgG- scFv Fusion）的体外还原/重新氧化动力学。此外，由于在纯化过程中的低pH病毒灭活步骤中，mAb还原与聚集有一定的关联性，因此该研究也在低pH处理、未经低pH处理及室温储存条件下评估了BisAb被酶还原后的重新氧化行为。

BisAb的还原动力学和片段化途径

使用重组TrxR1酶研究体外BisAb的还原行为，结果表明可以将每个完整分子百分比（LHHL）拟合为一阶指数衰减函数，以确定BisAb和亲代mAb对TrxR1的敏感性。这表明，还原发生得很快，并且单链抗体上额外的域间DSB对硫氧还蛋白的还原作用并无空间竞争关系。而且，在每个分子从完整抗体到完全还原的过程中形成了多种中间产物，包括缺少轻链的抗体（LHH）、重链二聚体（HH）和半抗体（LH）。此外，NR-CE无法检测到BisAb域间单链抗体DSB的还原，所有单链抗体DSB均位于BisAb重链内，因此NR-CE还原单链抗体DSB后，BisAb重链分子量无明显变化。

图 5 在TrxR1作用下BisAb的还原动力学 

BisAb硫氧还蛋白还原后的重新氧化过程

除了表征BisAb的还原行为外，还研究了重新氧化时的杂质分布。虽然体外重新氧化的研究不能完全重复细胞培养、收获和存储的条件，但仍可通过控制环境条件理解BisAb还原所致的杂质形成过程。使用硫氧还蛋白系统还原BisAb和亲代mAb，于室温下在含有空气的小瓶中重新氧化30天。结果表明，重新氧化后大部分BisAb的聚集水平皆比亲本mAb高。

为了进一步描述抗体重新氧化的模式，评估了氧化结束时的抗体种类。理想状态下，mAb的链间二硫键再氧化后会生成完全氧化的分子LHHL以及部分再氧化的分子LHH、HH和LH，后三者是符合预期的典型片段，可以使用NR-CE进行识别，此4种以外的非典型片段统一归类为“新异质体”。通过比较重新氧化和部分还原样品可知，还原的mAb储存30天后形成了一种新异质体——轻链二聚体（LL）。除LL外，还存在其它含量较低的一些新异质体。进一步在还原条件下用CE分析（R-CE）可知，新异质体是由于DSB错配所致。LL在常规蛋白质A捕获过程中可被去除，但可能导致产品产率降低。相比之下，BisAb产生了5种新异质体，而且这些新异质体与典型抗体片段（LHH、HH、LH）和（或）完整BisAb（LHHL）的理论分子量不相关，其中包括一种表观分子量在LH和HH之间的异质体。同样，经R-CE分析可知，BisAb再氧化后形成的新异质体也是由DSB错配所致。与亲本mAb相比，额外的单链抗体片段导致了更多的BisAb错配。质谱分析表明，在重新氧化的样品中并未形成其它裂解片段，例如：来自BisAb的单链抗体裂解。

低pH条件下BisAb的重新氧化过程

低pH病毒灭活是抗体纯化过程中的一个常见步骤，其可能会影响抗体的再氧化和聚集行为。本研究将经硫氧还蛋白系统还原的抗体以低pH处理，然后再中和，以确定低pH病毒灭活对还原BisAb样品中聚集体形成的影响。具体而言，经硫氧还蛋白完全还原后，用乙酸将其pH调至 3.5，再用Tris碱中和至pH 7.4。然后，在室温条件下重新氧化30天。

与前述未经低pH处理的样品相比，低pH处理的样品在重新氧化后聚集水平并无明显增加。而且，低pH值/中和处理的抗体重新氧化后出现的新异质体的比例也减少。例如：在pH值较低的样品中未观察到LL。推测其原因：抗体在低pH值下的静电表面性质导致了聚集和重新氧化行为的差异。当pH值为3.5时，BisAb和亲本mAb的轻链和重链片段上具有大量来自质子化羧酸侧链的带正电表面残基。因此，在低pH条件下，抗体片段之间的静电排斥作用可防止形成新异质体和聚集体。

综上所述，BisAb与亲本mAb对硫氧还蛋白还原表现出相似的敏感性，抗体形式会影响酶还原过程中的中间产物。此外，重新氧化过程中BisAbs产生的杂质种类更多，且比例更高。而且，重新氧化后杂质的形成过程与样品处理条件有关。根据这些结果，收获后若不立即纯化，储存含有BisA还原产物的收获液可能会导致蛋白聚集体和DSB错配。不过，立即纯化也不能完全阻止氧化条件下因二硫键错配而形成杂质片段。重新氧化样品过程中所形成的杂质种类较多，而且不易纯化去除，因此应尽量避免使用工程化的DSB。

思惟延伸

纵观全文，BisAb的结构复杂，向mAb中引入新的结构域，尤其是含有DSB的结构域，可能会增加分子的复杂性，从而加剧其还原和（或）片段化问题。虽然分子性质是该问题的决定性因素，但环境因素也能够在一定程度上影响还原和（或）片段化程度。根据本文内容，可以尝试从以下几方面进行优化以缓解BisAb还原和（或）片段化问题。

蛋白质主链的柔韧性及反应性侧链可能对蛋白质稳定性产生不利影响，正是由于这些区域的存在，才会使分子对蛋白质浓度、疏水性、离子强度、表面电荷、溶液pH值、辅料、搅拌、冻融和温度等工艺条件较为敏感。因此，一方面可以在分子筛选时尽可能避免引入这样的区域，另一方面可根据分子的敏感性特征对上述工艺条件进行合理设置和优化，以提高分子的稳定性。

DSB是还原和（或）片段化问题的重要影响因素。在分子设计时，可尽量减少DSB或者降低DSB的可及性，从而避免DSB暴露于还原性环境条件。细胞培养过程中，需要平衡细胞工艺表现和产品质量，在不影响工艺表现的前提下减少还原性物质的使用量，且保证充足的氧气供给。另外，可通过工艺优化提高细胞活率，避免细胞培养过程中的细胞死亡和破裂，从而减少胞内还原物质或酶的释放。在收获时，尽量采用剪切力小的收获方式，并且通入空气以避免产生还原性环境或导致细胞死亡。此外，下游工艺优化过程中，需尽量及时纯化，避免还原和重新氧化而产生更多杂质。而且，可以根据分子特征合理设计纯化策略、步骤顺序和工艺参数，例如：提前去除抗体还原产物或片段；在洗涤液中添加氧化还原对以保护抗体二硫键等。

此外，随着计算机辅助分子设计技术的不断发展，未来可能根据分子序列预测分子的稳定性，从分子筛选阶段开始避免引入不稳定性因素。

BisAb本质上也是一种mAb，虽然BisAb还原和（或）片段化问题的相关研究尚有限，但mAB的研究已经较为透彻。因此，除了从上述几方面解决BisAb的特有问题以外，还可参考mAb的历史相关研究来规避一些不稳定性问题，提高BisA的生产效率。

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