本文由李鸥编译，董小橙、江舜尧编辑。
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导 读
免疫细胞和粘膜组织中的微生物群之间的相互作用可以使个体朝着健康或疾病的方向发展。人们对人类呼吸道中的这些早期生命事件知之甚少。本文作者在婴儿出生后的第一年研究了其下呼吸道细菌定植和免疫系统成熟的情况。下呼吸道微生物群在出生后2个月内形成。在最初的几周内，有三种微生物特征明显，可被区分为生态失衡或多样化的，表现出不同的微生物毒性潜力，包括对粘膜防御至关重要的免疫球蛋白A（IgA）的蛋白水解。分娩方式决定早产儿的微生物群成分，但不是足月儿。胎龄是免疫成熟的关键决定因素，气道细胞逐渐增加了过敏原性细胞因子白细胞介素-33以及与IgA相关的基因的表达。这些数据揭示了人类气道中微生物和免疫的发展，并可能为预防呼吸道疾病的早期干预提供信息。
论文ID
原名：Early-life formationof the microbial and immunological environment of the human airways
译名：人类呼吸道微生物和免疫环境的早期形成
期刊：Cell Host &Microbe
IF：17.872
发表时间：2018年12月
通信作者：Benjamin J. Marsland
通信作者单位：Department ofImmunology and Pathology, Central Clinical School, Monash University,Melbourne, VIC 3004, Australia
背 景
出生后不久，我们的身体表面就会形成微生物群，随着时间的推移，这种微生物群可以指导免疫系统的成熟，并影响我们走向健康或疾病的轨迹。微生物群落的构成很大程度上取决于组织的部位，包括组织的物理特性(如氧分压、pH值和营养源)和免疫微环境(如抗菌肽、粘液、细胞因子和抗体)，它们构成了每个位点特有的宿主微生物相互作用的基础。目前，我们对宿主微生物相互作用的绝大多数知识都来自对肠道和上呼吸道的研究，这两个部位都很容易进入，而且充满了微生物。然而，较近期的研究发现，下呼吸道也存在微生物群，但由于下呼吸道采样技术具有侵入性，我们对呼吸道微生物群形成的认识是有限的。
尽管上下气道之间存在一些重叠，但呼吸道微生物群的组成因采样区域的不同而有所不同[1,2]，这说明了粘膜直接弥散和微吸入[3]。特别令人感兴趣的是微生物群失调（微生物组成失衡）的概念，它有助于增加炎症反应和免疫紊乱。对儿童的研究表明，鼻腔和鼻咽微生物群的组成与上呼吸道疾病和复发性喘息或哮喘有关。呼吸微生物群除了是病原体的看门人和调节对过敏原的反应外，在早期生命中对免疫系统的启动和形成也起着至关重要的作用。动物模型的数据表明，呼吸道内的微生物形成了早期的免疫反应和对哮喘的易感性。流行病学研究也指出婴儿时期的关键时期可以决定未来的呼吸道健康。
目前公认子宫是无菌的；然而，最近的研究报告胎盘和羊水中存在细菌DNA，尽管没有证据表明在子宫内有定植。出生后，健康新生儿上呼吸道可检测到多种微生物[4，5，6]。尽管研究之间缺乏共识，但一些环境因素（分娩方式、喂养类型、抗生素治疗）已被证明可影响上呼吸道微生物群的组成。然而，尽管最近有一些来自小鼠模型的证据，但对人类下呼吸道的定值时间和定植模式都知之甚少。
虽然在过去几年中，研究呼吸道微生物群发展的人类研究数量有所增加，但它们都是描述性的。在健康发育的肺中，宿主微生物相互作用的证据几乎不存在。从系统的角度来讲，出生时的免疫系统倾向于调节性和B细胞数量较少的2型表型，类别转换重组能力降低。在这项研究中，我们的目的是确定生命早期下呼吸道细菌定植模式与免疫系统的发育。我们的数据表明，呼吸道中不同微生物群落的形成与免疫系统的发育有关，并突出了胎龄和独特的宿主微生物相互作用，这些相互作用可能影响免疫成熟，并引导婴儿走向健康或疾病。
实验内容
1. 研究人群和样本选择
研究人群包括出生后年龄在1天到1岁之间的“健康”儿童，他们接受了选择性手术或呼吸支持的气管插管。严格的患者排除标准包括感染、败血症和胎粪吸入综合征（见实验模型和受试者详细信息）。对52例患者的气管吸出物进行细菌16SrDNA测序（n=52）和宿主RNA测序（n=16）。参与者的详细特征见表S1。为了避免低生物量样本产生虚假的微生物群信号，我们确定了与三种阴性对照（新气管插管冲洗、DNA提取和PCR）相关的样本选择。共有7个气管吸出样本聚集在阴性对照组中，随后从最终微生物数据集中移除（n=45）（图SA1）。这些排除的样本都是从小于8天的患儿身上采集的。
2. 出生后早期下气道微生物群落分为三个不同的类型
在出生24小时后的气管吸出物中可检测到大量的微生物群信号。所有下呼吸道样本无偏倚围绕中心点的划分 (PAM)聚类和主坐标分析(PCoA)识别出三个微生物群落(图S1B)；以下简称为微生物群概况(MPs)(图1A)。前两种MPs以葡萄球菌属（Staphylococcus）或解脲原体属（Ureaplasma）为主，而第三种MP以包括链球菌（Streptococcus）、奈瑟菌（Neisseria）、普氏菌（Prevotella）、卟啉单胞菌（Porphyromonas）、韦氏菌（Veillonella）和梭杆菌（Fusobacterium）等菌属组成(图1B)。使用Shannon指数进行样本内多样性分析显示MPs之间存在显著差异(Kruskal-Wallis卡方值=13.1, p < 0.01**)(图1C)。混合MP的多样性最高(n = 17)，葡萄球菌MP (n = 21)和解脲原体(n = 7) MP的多样性无差异。采用pan-bacteria 16S real-time qPCR检测微生物负荷。混合型（n=17）和葡萄球菌（n=21）MPs样本的细菌负荷没有差异，但与混合型（n=17）MP相比，解脲原体（n=7）MP样本的细菌负荷显著降低（wilcoxon post hoc test:w=85.5，p<0.05*）（图1D）。
3. 呼吸道的微生物群在出生后7周内成熟
所有三个MPs均在出生后3天内检测到（图1E）。然而，出生后7周以上的婴儿中，未发现解脲原体（n=7）和葡萄球菌（n=21）MPs，而在出生1年内的婴儿所有样本中均能检测到混合MP（卡方=14.3，p<0.001**）。然后我们讨论了细菌多样性建立的时间动态。香农指数与出生后年龄呈矩形双曲线关系。因此，我们使用双参数Michaelis-Menten方程来模拟总队列中细菌多样性随年龄的变化（n=45）（参数估计，t=7.33和2.07，p<0.001***和p<0.05*分别针对每个参数）（图S2A）。通过评估方差的均匀性和残差的正态性来检验模型假设（图S2B）。然后我们估计了多样性建立的断点，这里定义为从一种功能关系到另一种功能关系的转换。断点为出生后7周（1.76个月），之后多样性达到稳定的替代状态（图1F）。
图1 新生儿下呼吸道微生物群分为三个不同的微生物群，并在出生后7周内成熟。A. Bray-Curtis距离的PCoA评分图，用虚线将样本连接到聚类中心。颜色表示微生物群概况（MP），由总队列中PAM聚类确定（n=45）。B. 各MP中最丰富属（平均相对丰度>0.5%）的热图及相应的Ward聚类树图。C. 比较MP多样性的盒状图，由香农指数测量。D. 盒状图比较MP中细菌负荷。E. 生命第一年样本的累积分布，按MP进行分层。F. 采用michael - menten (MM)方程模型建立总队列(n = 45)中年龄相关多样性(Shannon指数)。红线表示将实验数据拟合成90%置信区间的2参数模型得到的模拟曲线。垂直灰线表示估计为7.01(1.76个月)周的临界点。
4. 胎龄是微生物群组成变化的主要驱动因素
我们在整个队列（n=45）中检查了一系列相关环境因素，包括出生时的胎龄、产后年龄、分娩方式、抗生素治疗和部位（医院）。以Bray-Curtis差异矩阵为响应变量的基于距离的冗余分析（DB-RDA）表明，在以环境因素为附加解释变量的模型中，胎龄对微生物群组成、分娩方式和出生后年龄有很强的影响（图2A）。从胎龄30周前出生的婴儿（n=22）采集的样本均未聚集到混合MP中（图2B）。仅在阴道分娩的新生儿（n=25）和与胎膜早破相关的紧急剖宫产（C-section）（n=1）中观察到解脲原体MP，而葡萄球菌MP在剖宫产分娩的新生儿（n=18）中占主导地位（图2B）。考虑到胎龄对微生物群组成的重要性，我们进行了两次单独的DB-RDA，第一次是早产儿（n=26）（图2C），第二次是足月出生人口（n=19）（图2D）。在早产模型（图2C）中，分娩方式对28%的差异有显著影响，在比较早产阴道顺产（n=12）和剖腹产（n=12）样本（图S3A）时，解脲原体是最具显著的属。其他丰度上有差别的属包括顺产的链球菌（Streptococcus）和Gemella菌属，剖腹产早产儿的丙酸杆菌属（Propionibacterium）和Planococcaceae菌属（图S3A）。在足月儿模型中，分娩方式的影响被完全消除（图2D）。在后者中，出生后年龄显著解释了14%的微生物群变异，随着年龄增多的儿童（n=10），其普雷沃菌属(Prevotella)、韦氏菌属(Veillonella)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)丰度也随之增加（图S3B）。当前预防性抗生素治疗（是/否）和部位（医院）均未导致任何模型的微生物群变异。MPS与儿童性别之间没有相关性。
图2 胎龄和早产方式对下呼吸道微生物组成的影响。A．基于距离的冗余分析（DB-RDA）表明，外在因素（胎龄，***P<0.001；分娩方式，**P=0.01；生后年龄，**P=0.002，抗生素治疗，和医院/场所）的联合和个体效应大小对总体队列（n=45）中微生物组成的影响。B．根据分娩方式在出生时随着胎龄的MPs的分布。每一行代表一名患者，根据MP着色，正方形代表出生。C．db-RDA表明，外在因素（分娩方式，***p < 0.001）的联合和个体效应大小仅对早产儿群体（n=26）的影响。D．db-RDA表明，外在因素（出生后年龄，*p= 0.017）的联合和个体效应大小仅对足月儿群体（n=19）的影响。
5. 胎龄对微生物群落结构和毒力的影响
为了进一步了解新生儿呼吸道中的微生物群落结构，我们建立了一个共生网络。我们观察到最丰富的细菌属之间有75个显著的联系(n = 21)，这些细菌属分为两个不同的模块，没有连接的边缘(图3A)。模块I包含混合MP的属特征，而模块II包含以解脲原体和葡萄球菌MPs为主的属，反映了早产儿和足月儿的特征（图2B）。模块I成员（n=11）的紧密中心值明显高于模块II（n=10），这表明混合型MP的患者存在细菌共生现象。链球菌属和奈瑟菌属除了高丰度外，还表现出最高的紧密中心值，提示它们可能是混合型MP的关键属。为了评估这些群落对宿主的影响，我们利用未观察到的状态重建（PICRUS）算法[7]对群落进行系统发育调查，并使用包含来自毒力因子数据库（VFDB）信息的自定义数据库[8]预测其毒力潜力。所有气道内抽吸样本（n=45）的毒力因子特征包括735个 KEGG Orthologis（KO）（图3B）。胎龄和分娩方式均解释了40%的致病性KO方差（各20%），在DB-RDA附加模型中，生后年龄贡献了5%。为了进一步探讨相关的潜在毒力机制，我们根据VFDB分类预测毒力功能。早产儿（n=26）与足月（n=19）的比较发现35个差异丰富的预测毒力功能，其中19个在足月组增加（图3c）。与免疫球蛋白A1（IgA1）蛋白酶功能相关的最大变化（log2倍变化=4.5，调整后p<0.001**）在以混合MP为特征的足月婴儿的样本中增加，表明潜在的宿主微生物相互作用。
图3 出生后早期下呼吸道细菌群落聚集成两个不同的细菌模块，具有不同的毒力潜能。A. 利用SparCC（成分数据稀疏相关）算法，从最丰富的属（n=21）推断出共生网络。连接边缘表示与共现值成比例的厚度的显著交互作用（单侧p值<0.05），并根据其对MP的贡献着色，不透明度随着中心度的增加而增加。B. 热图显示预测毒性KEGG直接同源(KO)丰度的系统树图Ward分层聚类的总队列(n = 45)。上色键是指样品MP、出生时的胎龄和分娩方式（阴道与剖腹产）。C. 预测毒力函数的火山图和相应条形图的差异分析，比较早产儿(26例)和足月婴儿(19例)的样本。对数2倍变化大于2且调整后P值小于0.05（两个上外侧象限）的预测毒力函数被认为是显著的（灰色虚线）。天蓝色和深蓝色表示早产儿组与足月组相比增加，与调整后的p值降低相比强度增加。
6. 胎龄决定免疫和微生物群
考虑到前2个月在微生物群建立中的重要性，我们将分析扩展到一个子集患者（n=16）的宿主转录组（表S1）。样本集包括7个葡萄球菌、2个解脲原体和7个混合MP组，胎龄为24-39周。主成分分析(PCA)显示，转录水平反映了整体水平微生物区系分析的差异(图4A)。考虑到胎龄是微生物群变异的主要驱动因素，在控制出生后年龄的模型中，以胎龄作为连续预测因子进行差异表达分析。我们鉴定出408个基因具有胎龄相关的表达模式(图4B)。白细胞介素-33（IL-33）是与胎龄最相关的明显上调的基因之一，其浓度与混合MP相关（妊娠期每周增加log2倍=0.59，调整后的p值=0.002**）（图4C）。然后我们进行了KEGG通路影响分析，以确定与胎龄相关的通路。随着胎龄的增加，IgA生成的宿主肠道免疫网络（hsa04672）显著增多（图4D），与足月儿预测IgA1蛋白酶功能的菌群增加一致(图3D)。主要组织相容性复合物II类的人类白细胞抗原（HLA）基因复合物和分泌性IgA（PIGR）的聚合免疫球蛋白受体是上调最多的基因之一（图4D）。其他明显增加的途径包括补体和凝血级联（hsa04610）和抗原处理和表达（hsa04612）（图S4）。
图4 宿主基因表达与微生物谱和胎龄一致。A. PCA评分以对数转换计数后再绘图，颜色代表MP组，虚线连接样本和聚类中心。B. 热图显示所有差异表达基因的表达，在转录组学数据集中（n=16）以胎龄作为一个连续的预测因子（校正为生后年龄），FDR阈值为0.1。C. 热图显示IL-33基因的表达及IL-33读数与胎龄的对应点图。D. 热图显示肠免疫网络中所有蛋白编码基因在IgA产生KEGG通路中的表达(hsa04672)。色阶表示Z行评分（从行平均值中得出SD），样本按胎龄增加排序，并用相应的MP标记。
讨 论
我们发现，下呼吸道微生物群在出生后2个月内逐渐成熟，多样性逐渐增加，达到稳定。解脲原体和葡萄球菌的失衡仅在出生后的2个月内被检测到，而混合剖面的组成类似于健康的成人肺微生物群，是足月出生的新生儿和较大的儿童的特征。这种定植时间与鼻咽部和其他身体部位的发现一致。在网络分析的基础上，我们认为链球菌和奈瑟菌可以代表关键属，对健康新生儿呼吸道的细菌群落结构具有重要意义。分娩方式对早期的微生物群定植的影响及其对健康作用仍然是一个有争议的话题,我们发现分娩方式可显著解释早产新生儿大部分微生物群的变化，加强了这种假设，呼吸道细菌定植的主要发生在出生过程中或出生后。在比较足月婴儿的样本时，我们无法检测到这种效应，这表明早产儿和足月儿的肺代表了不同的微环境，在细菌定植时具有不同的选择压力。在鼻咽部，分娩方式最近被证明对健康足月婴儿的微生物群成熟和稳定性有影响，而不是影响初始的细菌播种。令我们惊讶的是，预防性抗生素治疗并没有影响早产儿和足月儿人群的微生物群组成。然而，我们承认，我们可能无法捕捉到关于抗生素谱、剂量和治疗时间差异的复杂性。
本研究的一个关键发现是，出生时的胎龄是新生儿下呼吸道微生物群组成的主要决定因素，尤其是与其他外在因素（如分娩方式、抗生素治疗或部位（医院））相比时。在肠道中也有类似的观察报告，提出了内在宿主微环境因素（生境）比外在因素更能驱动微生物群选择和成熟的假设。葡萄球菌和解脲原体MPs主要存在于早产儿样本中。与其一致的是，这些属在研究早产儿呼吸道道定植的两项研究中，也是最丰富的。鉴于临床感染是我们严格的排除标准的一部分，这些MPs很可能反映出一种与低细菌负荷和缺乏临床体征相关的生物失调状态。解脲原体和葡萄球菌MPs在胎龄30周前尤为普遍，这是一个发展阶段，随着磷脂含量的增加，表面活性剂成分发生了显著变化，提供了一个富含脂质的环境，可能支持形成更为多样的微生物群。
为了进一步了解这些相互作用，我们以宿主免疫系统为重点，使用常用的生物信息学途径评估了细菌群落的元基因组毒力潜力。孕龄、分娩方式和出生后年龄预测毒力基因的程度较小。在功能水平上，预测的IgA1蛋白酶活性是足月儿童样本中最具毒力的功能之一。这与分析婴儿自身基因表达数据时，IgA生成途径的显著丰富与胎龄相关。在肠道中，IgA的产生是粘膜组织屏障保护的基本组成部分，并在微生物群的组成部分中发挥作用。相比较，我们对呼吸道中IgA反应的发展知之甚少。我们的数据强调了两种可能的，而不是相互排斥的解释。首先，呼吸道中的IgA生成可能由预先设定的与妊娠发育相关的内在途径来驱动。第二，不同呼吸道微生物群的形成可以加速IgA通路的诱导。重要的是，婴儿体内与IgA通路相关的匹配基因增加表达，以及与IgA对抗的微生物基因可预测的表达增加，高度暗示了气道微生物群与免疫系统之间的相互作用。究竟是微生物基因的表达驱动了免疫应答，还是免疫应答驱动了微生物，目前尚不清楚，尽管我们的数据表明它们之间存在功能上的相互作用。
我们研究的另一个有趣的发现是IL-33基因表达的诱导，对具有不同微生物群的足月儿童来说，这是一种能有效地驱动t-辅助 2型免疫反应的促过敏性细胞因子。全基因组关联研究都将IL-33与哮喘易感性联系起来，对小鼠的研究也同样表明，IL-33通路会使疾病恶化。我们可以假设，在生命早期，这种途径的失调，无论是通过微生物群的成分，还是通过其表达的内在时间，都可能影响对哮喘的易感性。
我们承认，我们的研究存在许多弱点，尤其是无法对婴儿进行纵向评估，即使我们有非常严格的排除标准，这些婴儿由于手术或呼吸支持而需要通气。然而，这些限制是不可避免的，因为采集样本具有侵入性，不能在更大的婴儿群体中进行。即使考虑到这些警告，我们的数据为该领域带来了一些见解。首先，人类下呼吸道微生物群的成熟很快，发生在出生后的前2个月。第二，早产儿的下呼吸道中至少有两个不同的微生物群落，这可能受到外部因素的影响，如分娩方式。足月儿童不易受到这些环境压力的影响，一项观察表明，较成熟的下呼吸道微环境可能对微生物群落施加更强的选择性压力。第三，我们发现宿主基因表达和预测的微生物基因表达共同发展，这表明婴儿下呼吸道正在进行宿主微生物相互作用。最后，我们数据提供了对人体气道中免疫细胞成熟阶段的深入了解，并表明胎龄是免疫成熟的主要驱动因素。综上所述，这些数据突出了新生儿体内宿主微生物相互作用的动态特性，可能是未来早期干预策略的一块踏脚石，这些策略将让婴儿向健康的方向发展。
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