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胎儿及婴幼儿时期的细菌定植在塑造后天的免疫系统中扮演重要角色。而且，越来越多的证据表明，早期的一些内外因素与日后患IBD风险有密切联系。本研究主要对IBD孕产妇在怀孕期间，其所产婴儿的菌群变化进行探究。在不同的时间点，检测了怀孕妇女（患有IBD和不患有IBD）与其婴儿肠道菌群结构上的变化。通过探究早期妇女IBD诊断，分娩方式，抗生素使用以及喂养习惯来评估这些外在因素对菌群结构的影响；此外，采用无菌小鼠分别接种IBD孕产妇及其婴儿粪便样本，检测小鼠肠道中先天免疫细胞数量的变化情况，从而评估IBD孕产妇及其婴儿肠道菌群对于肠免疫系统的影响。结果表明，患有IBD的产妇及其婴儿表现出更低水平的细菌多样性和结构组成（相比于非IBD个体）；母体IBD情况是婴儿菌群多样性（7，14，30，60，90天）的主要预测因子；具体来看，IBD孕妇所产婴儿表现出高丰度的Gammaproteobacteria，以及低丰度的Bifidobacteria。无菌小鼠接种了妊娠阶段后期IBD产妇和她们90天大的婴儿粪便样本后，其菌群多样性显著下降，并伴随着记忆转换型B细胞以及结肠处调节性T细胞数量的显著降低。主要结论，IBD产妇怀孕期间菌群结构呈持续异常状态，并诱使其胎儿粪便中的细菌多样性和丰度显著改变；而这些紊乱的菌群则触发了无菌小鼠肠道免疫系统的异常反应。
论文ID
原名：Infants born to mothers with IBD present with altered gut microbiome that transfers abnormalities of the adaptive immune system to germ-free mice
译名：IBD孕妇所生婴儿的肠道菌群变化及其在无菌小鼠中所诱导的适应性免疫系统异常现象
期刊：Gut
IF：17.016
发表时间：2019.04.29
通信作者：Dr Inga Peter
通信作者单位：西奈山医学院
试验流程图
Figure 1 实验设计：孕妇患有IBD（红色）和未患IBD（蓝色）为受试者，分别收集妊娠前中后期粪便样本和唾液样本，并进行临床及产科病史分析。分娩后，连续采集不同时间点婴儿粪便样本进行元分析。选取母婴配对粪便样本并接种于6~8周龄的野生型无菌小鼠进行免疫表型分析。
试验结果
受试者基本情况
本研究包括了200例来自于胎便研究组的受试者，其中孕妇121例（40例患有IBD），婴儿79例（其中26例产自于IBD孕妇），总共73对母子二人组。根据IBD情况结合孕妇年龄、胎龄、妊娠并发症、辅助生殖技术应用方式、怀孕及分娩期间抗生素的使用情况等因素，将孕妇的人口学及临床特征进行均匀分布。
患有IBD的母亲，其数据更接近Jewish（p=0.008）和nulliparous（p=0.024）。绝大多数患有IBD的孕妇（70.0%）呈现不活跃的疾病表征，且发作症状大多是轻微的。CD（克罗恩病）患者相比于UC（溃疡性结肠炎）患者具有更高频的肠切除术历史（p=0.02），表现出药物治疗下的差异。除了一部分较大比例的男婴是IBD妇女所产（p=0.013），其它诸如早产、低出生体重或出生后使用了抗生素或益生菌等占比在不同群体中是接近的。
IBD孕产妇在怀孕期间表现出持续的菌群失调
619份样品且每份超过1000条序列读数可进行下游分析（总读数：8857479；均值±SD/样品：133581±13977）。正如预期结果，多样性主要是由身体位点决定的。怀孕期间，IBD孕妇相比于对照拥有更低的肠道α-多样性，妊娠前期（T1）、妊娠中期（T2）表现出有统计学意义的差异（p=0.005，p=0.01），但妊娠后期（T3）无统计学差异（Fig 2A）。在IBD症状下整个孕期的总体菌群α多样性随着时间的推移表现出相反的趋势：对照组从T1到T3期间呈持续下降，而IBD患者则表现出一个并不显著地轻微增长（figure 2A）。以无加权UniFrac distances进行PERMANOVA分析，发现IBD状态下肠道菌群的β多样性，在每个阶段的妊娠期均表现出显著不同（figure 2B）。生物标记物分析对IBD妇女肠道微生物组的相对丰度进行比对，发现相比于对照，其所造成不同之处主要在于Gammaproteobacteria类的富集以及Bacteroidetes phylum的缺失（figure 2C）。T3中，来自Enterobacteriaceae科中的一种未定义的属在IBD孕妇中高度富集；采用LEfSe分析进一步确定，发现Proteobacteria门下14个分类出现了高度富集。进一步采用MaAslin分析，对T3样品（n=80）进行处理，并加入参与者类型、种族、胎次以及孕期抗生素使用情况，发现IBD孕妇的Enterobacteriaceae类富集显著。怀孕期间服用过巯嘌呤类药物或者生物制剂的孕妇与患有活跃或不活跃疾病的孕妇之间并无显著性差异。此外，不同时间点下IBD孕妇与非IBD对照组之间的口腔菌群的α多样性或β多样性并无显著差异。
Figure 2 IBD孕妇肠道菌群结构。（A）箱线图描述了IBD（红色）和非IBD（蓝色）孕妇菌群结构（α多样性）丰度的平均值和变异系数，显著差异出现在妊娠早期（T1）（p=0.005）和妊娠中期（T2）（p=0.01），但妊娠后期（T3）并无显著差异。（B）根据IBD状况进行分组的样品之间总体微生物组的不同（β多样性）。采用未加权UniFrac distances测定并使用非度量多维尺度图显示差异。IBD（红色）和非IBD（蓝色）孕妇菌群结构在不同妊娠期均表现出显著的β多样性差异。（C）线性判别分析显示IBD和非IBD孕妇之间不同的菌群结构特征。
孕产妇IBD状况预测婴儿肠道菌群多样性与分类
对实验数据进行分析的过程中，79例婴儿已经出生，其随后的3个月里进行了306份高质量粪便样品的收集用以分析。总体而言，婴儿粪便样本中细菌多样性随着时间推移而有所变化。IBD孕产妇所产婴儿的肠道微生物组，相比于对照组孕产妇所产婴儿，呈菌群的低水平多样性和变异（figure 3）。具体来看，基于IBD状况下，在第7天，14天和90天处α多样性具有显著差异（Wilcoxon p=0.05，0.03，0.02；figure 3A）。此外，孕产妇IBD诊断结果是一个预测婴幼儿β多样性的重要因子（figure 3B）（每个时间点的单变量和多变量PERMANOVA p<0.05），此外，分娩方式，抗生素使用，喂养方式以及早产也与不同时间点的整体菌群丰度密切相关（table 2）。在顺产和剖腹产婴儿中进行分层分析，发现孕产妇IBD诊断依旧是预测微生物组多样性的重要因子（排除了分娩方式）。同样地，排除了只有奶粉喂养的婴幼儿粪便样本后，这种差异依然存在。随后，我们采用LEfSe分析所有时间点下的分娩方式，该方式也是一种预测生命早期微生物组特性的主要因子。我们发现，IBD孕产妇所产婴儿表现出Gammaproteobacteria类细菌的高度富集，而Bifidobacterium属有所下降（相比对照组）（figure 3C），而这一趋势一直持续了3个月（figure 3D，E）。随后，我们测试了随着时间推移，不同暴露方式对于不同种属相对丰度的影响。我们发现产孕妇IBD诊断和专一的喂养方式与Bifidobacterium属相对丰度的降低密切相关（对数尺度分别下降1.4倍，p=0.007和1.7倍，p=0.048；table 3）。调整协变量之后，产孕妇IBD状况成了头三个月唯一预测引发结肠炎的Gammaproteobacteria类群相对丰度变化的重要因子（p=0.002）。
Figure 3 孕产妇IBD状况下生命早期多个时间点的微生物组特征。（A）分娩后，相比较不同时间点IBD妇女所产婴儿（红色）和非IBD妇女所产婴儿（蓝色）菌群结构的α多样性。（B）采用未加权UniFrac distances测定分娩后不同时间点，孕产妇IBD状态下婴儿的β多样性。（C）采用LEfSe分析IBD妇女（红色）和非IBD妇女（绿色）所产婴儿之间的最显著地差异性细菌。（D和E）孕产妇IBD状况下代表性细菌分类群随时间的变化。
IBD状况决定了无菌小鼠（GFM）中适应性免疫系统的组成变化
我们首先比对了接种了产孕妇及其婴儿粪便的GFM的粪便中，总体细菌丰度（β多样性）变化，并探究了产孕妇IBD状况（p=0.0001和p=0.003）引起的显著差异。之后，我们将接种了产孕妇或婴儿粪便GFM肠道内T细胞、B细胞、树突细胞以及ILCs进行特征性子集分类。非IBD孕产妇/婴儿粪便和未接种的GFM作为对照。由于小肠及大肠的粘膜固有层表现出良好的一致性，因此我们把分析目标只专注于结肠粘膜固有层。在脾脏、集合淋巴结以及肠系膜淋巴结之间并未检测到显著差异，在定植了IBD孕产妇及其婴儿粪便样本和非IBD接种的对照之间的GFM中，并未观察到树突细胞（DC）子集或ILCs到的变异。淋巴细胞中，虽然没有检测到总体T细胞以及CD4+T细胞有差异，但接种了IBD孕产妇粪便样本的小鼠，其肠系膜淋巴结中CD19+B细胞有显著下降。
此外，我们发现适应性免疫系统中的差异表现出一致且可重复性。具体来看，接种了CD孕产妇及其3个月大婴儿粪便样本的小鼠，其结肠粘膜固有层中，class-witched记忆B细胞（活的CD45+CD19+CD138−IgD−IgM−细胞）比例相比于对照组小鼠，表现出显著降低（p<0.005）（figure 4a）。在接种了CD环境下婴儿粪便样本的小鼠肠系膜淋巴结（MLN）中观察到了相似的结果，但源于CD孕产妇的粪便样本并未出现相似结果。
在转化记忆B细胞中，内稳态的IgA+转化记忆B细胞在定植了CD孕产妇或其婴儿粪便样本后小鼠的结肠LP处，呈显著下降（p<0.01），但MLN处并无变化（figure 4b）。在接种了CD或非CD粪便的小鼠中，IgA+浆细胞或者粪便中IgA水平无显著差异。相比于对照，接种了CD孕产妇粪便样本的小鼠，在结肠LP（p<0.005）和MLN（p<0.05）处的调节性T细胞（TREG，live CD45+CD3+CD8−CD4+Foxp3+细胞）频率降低；接种了孕产妇（已诊断为CD）及其婴儿粪便样本的小鼠并未表现出差异（figure 4C）。
Figure 4 接种了CD孕产妇及其3个月大婴儿粪便样本的无菌小鼠，其适应性免疫细胞相比于非CD对照表现出显著地异常发育。（A）分离自无菌小鼠结肠粘膜固有层和肠系膜淋巴结（MLN）中的Class-switched转化记忆B细胞（aqua−, CD45+CD19+CD138−IgD−IgM−），这些无菌小鼠分别接种了非CD，CD孕产妇以及她们3个月大婴儿（非CD或CD婴儿）的粪便样本。累计数据表明活的CD19+CD138−B细胞中的class-switched转化记忆B细胞在结肠粘膜固有层或肠系膜淋巴结（MLN）中所占百分比。（B）累计数据表明活的CD19+CD138−B细胞中的IgA+ class-switched B细胞（aqua−, CD45+ CD19+ CD138− IgD− IgM− IgA+）在结肠粘膜固有层或肠系膜淋巴结（MLN）中所占百分比。（C）累计数据表明活的CD45+CD3+CD8− CD4+细胞中的调控T细胞（TREG）（aqua−, CD45+ CD3+CD8−CD4+ FoxP3+）在结肠粘膜固有层或肠系膜淋巴结（MLN）中所占百分比。*P<0.05，**p<0.01，***p<0.005。CD，克罗恩病；NS，无显著差异。
讨 论
我们发现IBD孕妇及产妇的微生物组学特征为，在妊娠前中期呈低α多样性，妊娠后期相比于对照组妇女呈不同的β多样性（figure 2A，B）。差异主要体现在Bacteroidetes相对丰度的下调以及Proteobacteria相对丰度的上调（figure 2C）。具体来看，IBD孕产妇所产婴儿表现出细菌多样性的下降（出生一周），相比于对照组婴儿早期的3个月，表现出肠道细菌总体组成上的差异（figure 3A，B）。这些结果与之前文献报道中的多种孕产妇疾病的影响结果相一致，如肥胖、湿疹、HIV以及孕期糖尿病孕妇所产婴儿的微生物组学特征变化。我们发现早期的微生物变更主要体现在Gammaproteobacteria丰度上升，而Bifidobacterium减少（figure 3C–E），这也反映出这些婴儿的母亲，以及成人及儿童时期的IBD患者所存在的一些特定模式。双歧杆菌是婴儿肠道中最早定植的菌种，被认为是有益于宿主的细菌，刺激免疫系统趋于成熟，同时抵御肠道病原菌。有研究表明，双歧属能够保护并缓解结肠炎，而在IBD患者中，多种双歧杆菌混合使用对于特定的位点有不俗的疗效。而Proteobacteria常常与肠道炎症密切相关，这其中包括了与IBD的关联。
在每一个时间点上可以看到，孕产妇IBD状况是影响婴儿菌群结构组成的主要且最直接因素，其它因素，诸如分娩模式、喂养方式、抗生素使用、早产等也能够影响整体菌群结构组成，但并非主要因素。剖腹产和抗生素的使用在怀孕及婴儿早期时间段会增加婴儿日后患IBD的风险，而婴儿期母乳哺育的方式能够避免IBD的发展，甚至避免病变。而且，有研究表明IBD妇女所产婴儿中，母乳哺育方式伴随着相对更高丰度的双歧杆菌。孕期以及早期生活是一个关键时期，这个时期的微生物和特定的微生物代谢物是免疫系统发育成熟的基础物质和必要条件。因此，为了评估观察中的IBD相关联失调的功能性结果，我们将对应的孕产妇（有或者没有CD）以及她们婴儿的粪便样本接种于无菌小鼠。发现CD特征基础上的小鼠，其微生物组成结构有显著地不同。有趣的是，妊娠后期CD孕妇的微生物组接入无菌小鼠后，造成了免疫系统原始稳态的破坏，伴随着结肠处FoxP3+TREG和记忆B细胞数量显著下降，而相比于对照组小鼠，MLN处的FoxP3+TREG也出现了下降（figure 4）。此外，CD孕产妇所生3个月大婴儿的粪便样本也造成了小鼠结肠LP和MLN中转化记忆B细胞数量的下降，TREG在抑制全身和粘膜免疫激活以及调控肠道炎症过程中起到了重要作用。相似的，IgA是黏膜表面的主要抗体，对于粘膜内稳态十分重要。IgA与共感细菌的促炎抗原表位的下调相关联，而生物膜的分泌则有助于共生菌的生长，并促使肠道细菌定向作用于M细胞，并伴随着树突细胞成熟，白介素-10产生，以及免疫反应的FcαRI-调控抑制。有研究表明，IBD患者粘膜表层的聚合的IgA产量受损，并伴随着外围IgD-CD27+B细胞数量的下降（1岁婴儿血液中，由IBD孕妇所产）。前人研究表明，肠道细菌的定植模式很可能影响人体B细胞的成熟，而早期的肠道菌群可能能够加速其成熟。同时，接种了IBD粪便样本的无菌小鼠，结肠TREG和IgA+ B细胞亚群的频率降低，表明了这两种黏膜免疫系统内稳态的关键因素可能与IBD引发的生态失调有关。
我们的研究结果表明，生命早期环境、微生物组学与未来IBD发展状况之间存在潜在联系，早期的微生物组结构的异常对于敏感期的免疫系统发育与成熟有直接影响。特别是，生命早期细菌多样性较低是很多疾病（如哮喘、过敏）发展和病变的先兆。考虑到IBD诊断中肠道菌群所扮演的中心角色，我们认为，本研究中观察到的模式，至少能够部分解释除了已确定的共同遗传风险之外IBD在后代中的患病风险。
本研究的优势在于涵盖了独特的前瞻性群组，即孕产妇（有或者无IBD）和其婴儿，以及连续采样和数据分析。首次研究了孕产妇和早期生命环境中微生物组学上的急剧变化。但本研究缺陷，在于没有办法修正所有潜在的干扰因素，如IBD类型，疾病位点，活性，并发症，药物治疗以及其它的IBD相关变量（可能影响微生物组的因素）。数量较小的一部分婴儿，这些婴儿因为暴露在抗生素和独家配方喂养下，因此使我们无法进一步评估这些环境因素之间的相互作用与影响，很可能这些因素会影响婴儿肠道菌群的定植。而且，并不能使用婴儿的血液，因此，我们采用验证模型无菌小鼠（GFM）来预测失衡下的微生物组对于免疫相关联结果的影响。在动物模型中，我们阐明了CD患者粪便在健康小鼠中，所诱发的肠道微生物组和免疫学变化。然而，CD相关联生态失调对于结肠炎敏感性的影响并不能推测是否有绝对的关联，同时也不能推测并决定出引起这些观察到的结果的潜在病理生理学机制。需要近一步的研究来探究我们在鼠类黏膜炎症中所看到的显性结果。最后，虽然我们清晰的观察到了适应性免疫系统内的可再生变化，但是，在先天免疫细胞中并没有确定存在相同的变化。而敏感性缺乏、炎症较轻或者替代细胞子集内不同变化可能是造成这些不同现象的原因。
总体而言，采用前瞻性队列研究，我们发现孕产妇的IBD情况与其婴儿菌群结构的变化具有密切关联。此外，患有CD的孕产妇及其婴儿菌群结构，其所对应的免疫系统发育呈不平衡态，且在人源小鼠中表现出决定性内稳态因素的缺乏。通过评估这些关键因素对患有IBD的妇女及其婴儿微生物组特征的影响和改变，最终可以为IBD诊断开发出新策略以及为该疾病的新型预防和治疗方式提供新思路。
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