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植物根际微生物群落之间形成了复杂的菌群生态网络，其中多个物种可能相互之间具有互利共生、剥削、偏害、偏利、竞争和中立等相互关系。研究人员认为植物根际土著菌群成员间的相互作用关系可能会影响着土传病原菌，如青枯病（Ralstonia solanacearum）等在植物根际的定殖及对植物根系的入侵。为了探究土著微生物群落成员间的相互作用关系是如何影响土传病原菌入侵的，研究人员以六种根际土著细菌（Flavobacterium johnsoniae WR4，Chryseobacterium daecheongense WR21，Delftia acidovorans WR42，Bacillus amyloliquefaciens T-5，Lysinibacillus sphaericus HR92和Ralstonia pickettii QL-A6）为材料，构建简易的模式微生物群落，利用简单的两两相互作用预测复杂微生物群落的互作关系以及对病原菌入侵的抵抗力。研究人员首先表征了土著微生物群落之间两两互作关系（对抗Competition和便利Facilitation）和抵御病原菌入侵的能力，然后探究是否可以利用这些相互作用预测更复杂的群落抗入侵的能力。结果表明便利型土著微生物群落会促进病原菌的入侵（土著微生物之间相互提供“便利”，也为病原菌入侵提供“便利”的机会），而对抗型土著微生物群落则抑制了病原菌的入侵（相互制衡的群落相互关系可以有效制约病原菌入侵）。本研究发现简单群落成对相互作用可以较好地预测多物种复杂群落的互作关系以及对病原菌入侵的抵抗能力。该研究对于筛选有益微生物，开发高效提升根际健康的复合益生菌群产品有重要参考意义。
论文ID
原名：Facilitation promotes invasions in plant-associated microbial communities
译名：便利化促进植物相关微生物群落的入侵
期刊：Ecology Letters
IF：9.137
发表时间：2018.11
通信作者：韦中&沈其荣
通信作者单位：南京农业大学资源与环境科学学院
实验设计
本文以pYC12-mCherry质粒标记的青枯病（Ralstonia solanacearum）菌株QL-Rs1115作为实验中的入侵病原体。利用从番茄根际分离出的6个可以抑制青枯病的细菌菌株（Flavobacterium johnsoniae WR4，Chryseobacterium daecheongense WR21，Delftia acidovorans WR42，Bacillus amyloliquefaciens T-5，Lysinibacillus sphaericus HR92和Ralstonia pickettii QL-A6）建立模式土著微生物群落。首先通过比较单独培养和共培养微生物种群密度的大小，判断土著微生物之间成对相互作用的类型及方向性，并预测多物种之间的相互作用，并通过qPCR进行验证。然后分别测量48种不同的单一碳源上R. solanacearum和6个土著群落的生长情况，测定入侵物种与土著群落物种之间的资源竞争，并利用上清液分析法测定入侵者和土著群落物种之间的直接拮抗性。最后通过体内测试和体外测试土著群落物种之间相互作用对群落入侵抗性的影响。体外测量将所有可能的多物种群落微生物进行组合，初始细胞密度为105细胞/mL，每种组合3个平行。土著群落组合置于96孔板中，在30°C下（170转/分）暴露于mCherry标记的R. solanacearum（104个细胞/毫升）的入侵下培养。用Spectramax M5分光光度计检测细菌密度判断入侵成功率。体内测量则进行50天的番茄植株温室实验测量体内入侵成功率。每个土著微生物群进行3个平行，每个平行包含6株番茄幼苗（700 g无菌土培养到三叶阶段），同时设置阳性（只有入侵者）和阴性（没有细菌）对照。每2天随机重新排列苗板，每7天监测病情进展。最终用qPCR测定青枯菌的丰度。用SPSS和R分析结果，评估了土著微生物群落间促进相互作用比例和基于成对土著微生物群落间相互作用的平均促进强度对入侵（病原体密度和疾病发病率）的独立影响。
实验内容
1 体外和体内测试两物种土著物种相互作用预测入侵结果
所有物种之间都有负效应和正效应，而这些效应的大小和方向因特定物种而异（图1a）。尤其是解淀粉芽孢杆菌对其他土著群落物种具有很强的拮抗作用。（图1a）。此外，我们发现9个配对群落表现出拮抗性，6个配对呈现相互促进的作用（图1b）。平均而言，相互促进的两种群落达到更高的种群密度（R2=0.79，P <0.001），而拮抗的两种群落对彼此的抑制性更强（R2=0.32，P =0.029）。土著微生物种群资源之间未发现生态位重叠，这表明便利化不是由于生态位互补而产生的。这些结果表明，与资源竞争相比，直接抑制的强度对解释土著微生物群落之间的成对互作类型更为重要。
图1 微生物种群成对相互作用的类型和相对强度。（a）显示土著微生物物种之间所有成对相互作用的强度和方向性的网络图。线条的粗细代表强度，绿色和红色代表不同物种之间的促进或拮抗作用。（b）15对相互作用中有9对为拮抗（共培养密度<单培养密度），6对为相互促进（共培养密度>单培养密度）。
为了将成对相互作用的类型与入侵的可能性联系起来，我们比较了R. solanacearum在入侵便利型和拮抗型两个土著物种种群中的成功率。与阳性对照组（图2a-f中红色虚线）相比，在体外和体内测试均存在土著物种的情况下，病原菌密度显著降低。病原菌受抑制的强度可以通过土著物种之间的成对相互作用类型来预测：体外（F1,43 = 16.02, P < 0.001,图2a; R2=0.49, P < 0.0001, 图2b）和体内（F1,43 = 24.40, P < 0.001,图2c; R2=0.26, P = 0.0021,图2d）测试中，便利型的病原体密度明显比拮抗型更高。与之一致的是，便利型青枯病的发病率也高于拮抗型土著菌群（F1,43 = 9.03, P = 0.004,图2e; R2 = 0.14, P = 0.013,图2f）。从机制上讲，这可以解释为病原菌抑制作用的丧失，如便利性的菌群密度和直接入侵抑制效果之间的负相关（r2=0.45，p<0.0001，图S6）。综上所述，相互拮抗的两种土著群体不仅对自身具有更强的抑制作用，而且对入侵者也具有更强的抑制作用。
图2 体外和体内测试成对土著菌群相互作用的类型预测入侵成功率。
2 基于成对相互作用预测与验证多种群中入侵率
土著微生物的相互作用可以很好地解释体外（R2:0.45，p<0.0001）和体内（R2:0.28，p<0.0001）测试中入侵者的丰度，以及体内青枯病的发病率（R2:0.18，p=0.0002）（表1）。在所有受试土著菌群中，体外入侵者密度的增加可以很好地解释便利型相互作用的比例。同样地，随着土著菌群中便利型相互作用比例的增加，番茄根际青枯菌密度（R2=0.22，p=0.0004，图3b）和青枯病发病率（R2=0.21，p=0.0004，图3c）均显著增加。预测的平均便利化的强度很好地解释了体外（R2=0.45，p<0.0001，图3d）和体内（R2=0.21，p=0.0005，图3e）青枯菌密度的增加，并与青枯病发病率呈正相关（R2=0.19，p=0.0193，图3f）。预测和观察到的便利化平均强度彼此呈正相关（R2=0.44，p<0.0001，图S7），表明成对相互作用可用于预测多物种菌群的相互作用。正如预期的那样，入侵者密度也随着观察到的体外（R2=0.26，p<0.0001，图3g）和体内（R2=0.17，p=0.0019，图3h）便利化平均强度的增加而增加。然而，观察到的平均便利化强度与青枯病发病率没有显著相关性（图3i）。
图3入侵者数量与疾病发病率与多物种群落内预测和观察到的平均促进强度之间的关系。
在相互拮抗的土著菌群中观察到的入侵成功率较低，可能是由于入侵者受到的直接抑制水平较高和/或入侵者和土著菌群成员之间的资源生态位重叠。我们发现，直接的病原菌抑制和高资源生态位重叠降低了体外和体内的入侵者密度，而只有直接的病原菌抑制显著降低了疾病发生率（表1）。直接病原菌抑制与预测和观察到的平均便利化强度呈负相关，表明拮抗性多物种群落对入侵者的抑制作用更强（图S8）。解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和F. johnsoniae对体外和体内病原菌密度有强烈的负作用（表S7）。然而，只有解淀粉芽孢杆菌对疾病的发病率有显著的负作用，而C. daecheongense对疾病的发病率有轻微的正作用（表S7）。总之，这些结果表明，在体外和体内，成对的土著菌群相互作用可以预测多物种菌群情况下的病原菌入侵率，这些影响主要与直接病原菌的抑制有关。
结 论
在这里，我们研究了土著菌群的相互作用与细菌植物根际群落抵御入侵的关系。我们发现，在实验室和根际，便利化的两个物种群落比拮抗的土著菌群更容易被入侵。此外，我们可以利用成对的相互作用来预测包含多达6个土著物种的多物种群落的入侵结果。具体来说，以便利化互动比例高为特征的菌群，其预测和观察到的便利化平均强度高，则其更容易受到入侵。从机制上讲，这与拮抗微生物直接抑制入侵者有关，而与入侵者和土著微生物成员之间的资源竞争程度较低。总之，这些发现表明，相对简单的成对相互作用的结果可用于预测多物种微生物群落的入侵，特别是当拮抗和便利化作用与抗入侵性强相关时。
迄今为止，主要从资源竞争和生态位抢占的角度考虑了抗入侵的机制。我们的研究结果表明，在入侵的背景下，也应考虑便利化相互作用。虽然很难精确确定便利化和入侵之间的确切机制，但最可能的解释是对病原菌抑制的丧失随着平均便利化强度的增加（图S6）。这与先前的发现一致，发现拮抗活性的增加可增加假单胞菌土著菌群的抗入侵能力。另一种解释可能是，与拮抗的土著菌群相比，便利的土著菌群在与侵略者争夺资源方面效率较低。然而，这可能起到了相对较小的作用，因为在体外和体内测量时，资源生态位重叠只对入侵者密度有显著的负面影响，而对疾病发生率没有显著影响（表1）。此外，我们在体外测定的资源竞争指数可能高估了资源竞争的强度，或低估了根际生态位空间的大小，导致与入侵的相关性较弱。此外，便利的互动可能增加了土著菌群的生态位空间，有利于入侵者，这可能会作为副作用，进而促进入侵。例如，以前的研究已经证明，细菌可以显示不同饮食聚糖之间的饮食偏好，这可以延长物种在共培养中的共存时间。这种饮食偏好可能会使一些资源不被充分利用，从而提供入侵的机会。也有研究表明，多糖的分解可以使释放多糖分解产物的物种共存，这些分解产物被其他不能单靠多糖生长的物种（受体）消耗。因此，如果入侵者自身无法在主要基质上生长，便利化相互作用可能有利于入侵者。虽然根据我们的数据很难验证这些假设，但我们发现，与单独培养相比，便利化的菌群总体上更具生产力，并且在一起培养时达到更高的总细胞密度（图S4）。这支持了这样一种观点，即便利土著物种从彼此的存在中受益（例如通过交叉喂养），这也可能通过创造空置的生态位空间使入侵者受益。因此，土著菌群的承载力可能是生物入侵的重要预测因素。
除了土著菌群内部的互动，土著菌群与入侵者之间的互动也是入侵的良好预测因素，尽管程度较小（图3和表1）。虽然目前还不清楚土著菌群产生了什么样的确切化合物，但之前的研究表明，土壤细菌能够产生各种各样的抗菌剂，这些抗菌剂经常抑制青枯菌。例如，本研究中使用的解淀粉芽孢杆菌T-5菌株在实验室和植物根际均能有效抑制青枯菌，该菌株对本研究中的病原菌密度和疾病发病率也有最大的负面影响（图s1）。此外，F. johnsoniae在体外和体内对病原菌密度都有负面影响。总之，这些结果表明，通过毒素抑制病原菌可能是由这些物种的存在介导的。
一般来说，成对的土著菌群互动可以很好地预测多物种社区中观察到的入侵结果（图3，表1）。然而，观察到的平均便利化强度与青枯病发病率之间没有相关性（图3i）。这表明，虽然体外机制（资源竞争和反生物作用）可以有力地预测在更复杂的体内环境中的入侵，它们并不能解释更复杂自然环境的所有方面。对于这些差异，有许多潜在的解释应该在未来的研究中加以验证。首先，研究微生物介导植物免疫的作用很重要，因为致病性和非致病性细菌都能触发或抑制植物免疫。此外，参与病原体抑制的几种细菌次级代谢产物也会影响植物免疫力：例如，荧光假单胞菌产生的2，4-二乙酰氯三酚（DAPG）或枯草芽孢杆菌产生的表面活性肽具有这样的双重功能。第二，我们使用的根际细菌群落相当简单，因此，基于成对物种相互作用的预测应该在未来更复杂的多营养群落中进行测试。最后，我们的预测指标只估计了平均净效应，没有区分这两种或只有一种物种受益，反之亦然。但考虑到相互作用的方向性和潜在的高阶相互作用可能会改善这些预测，这种方法似乎是入侵结果的一个很好的预测因子。
总之，我们的研究结果表明，关于成对共培养中物种生长的定性信息可用于预测多物种群落入侵的结果。而且我们的研究成果可以广泛应用于不同的生物问题，但它们可以为作物保护提供直接的解决方案。细菌性病害对农业的威胁越来越大，最近的证据表明，根际微生物群在控制疾病发生方面起着重要作用。了解某些微生物群对入侵更具抵抗力的特性，可能有助于利用有益的细菌群落保护作物。我们认为，高度拮抗的微生物群落也可能有效地抑制病原体入侵。
评 论
细菌性病害对农业的威胁越来越大，根际微生物群在控制疾病发生方面起着重要作用。然而，在多样性-抗入侵的背景下，根际微生物相互作用的类型和强度与抵御病原菌入侵的关系往往被忽视。本文探索了两种土著菌群相互作用的类型（便利性和拮抗性）和强度在多大程度上可以预测复杂的多物种细菌群落抵御入侵的能力。本研究从番茄植物根际分离出六种非致病性细菌（土著菌群）和青枯菌病原菌。通过体外和体内测试发现，便利性和拮抗性的物种相互作用可以预测入侵的成功率：便利性土著菌群更容易受到入侵，而拮抗性土著菌群的入侵成功率要低得多。这说明物种之间拮抗性是抵抗病害入侵的一个重要决定因素，而便利性可能会通过减轻拮抗性相互作用或释放入侵者的空位空间来促进入侵。
（1）科研 | Nature子刊：根系分泌的代谢物通过塑造根际微生物群来驱动植物-土壤对生长和防御的反馈
（2）科研 | ISME：氮沉降对全球土壤微生物的负效应 (国人作品)
（3）科研 | ISME：升温改变功能性微生物群落增强有机碳分解（国人作品）
（4）科研 | Nature：地球表层土壤微生物群落的结构和功能
（5）科研 | ISME：空间结构对土壤微生物间一种新型营养缺陷相互作用的影响
（6）综述|Nature review microbiology：多年冻土的微生物生态学
（7）科研 | 多环芳烃污染对土壤微生物多样性及共代谢途径的影响
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