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作为众多生态过程的重要调节者，土壤微生物在干扰后的生态系统恢复中发挥着重要作用。第二代测序技术已经广泛应用于研究生态系统恢复过程中的微生物类群的变化，但仅描述微生物群落结构的数据很难与微生物介导的生态系统过程联系起来。鸟枪法宏基因组测序提供了在微生物群落和生态功能恢复过程中检查数千种功能基因变化的机会。我们分析了15个土壤宏基因组，这些土壤是从重新造林以来的6到31年的土壤时间序列以及未开采的参考土壤中采集的。微生物类群和功能的变化表明微生物从营养丰富向营养贫瘠的类群转变，伴随着难分解碳源代谢和植被的影响增强。与转座子、毒性、防御性和应激反应相关的基因增加表明，随着恢复时间的增长，微生物之间的合作和竞争相互作用更强。在N循环相关的微生物类群中，氨和亚硝酸氧化菌在恢复过程中明显增多，但关键N循环功能基因变化不大。在所有恢复造林的土壤中，甲烷氧化菌和甲烷单氧酶基因的相对丰度较低，这解释了以前的观察结果，即在恢复造林后的31年里，这些地点的甲烷消耗量没有恢复。这项工作有助于确定土壤微生物群落与生态系统恢复之间可能存在的联系机制，特别关注了氮循环和温室气体排放，以便更好地了解土壤微生物在生态系统功能恢复中发挥的作用。
论文ID
原名：Changes in microbial functional genes within the soil metagenome during forest ecosystem restoration
译名：森林生态系统恢复过程土壤宏基因组中微生物功能基因的变化
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
发表时间：2019
通信作者：Shan Sun
通信作者单位：School of Plant and Environmental Sciences, Virginia Tech
实验设计
本研究土壤样品于2014年9月在弗吉尼亚州怀斯郡(Wise County)的一个曾经的矿区，按照恢复造林的时间（6年，12年，22年和31年）的时间序列取样，并在附近选取未采矿的森林样点作为对照。在每个样点设置3个直径为10m 的圆形样方，在每个样方中，取3个5cm见方0-10cm的土样，混合为1个，总共15个混合土样，放入冰中，带回实验室-80℃保存。使用PowerSoil Soil DNA 分离试剂盒(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)从0.25g土壤中提取DNA，其含量使用Qubit 2.0 荧光计 (Invitrogen, USA)测定。对于鸟枪法宏基因组，所有样品的DNA浓度用PCR试剂(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA) 配平，并使用M220-聚焦超声波发生器在50μL离心管中放置90秒，将DNA剪切成300bp。然后，在Illumina Hiseq平台上将所有15个DNA文库进行扩增并测序。读取的原始序列上传至MG-RAST进行质量控制和注释，用Genbank 数据集来注释微生物类群，用Subsystem 数据集来注释功能基因。注释过滤参数具体设置为80%的最小辨识度，20bp的最小对齐长度和1×10-5的E-value，比默认值更严格。在MG-RAST的输出文件中，功能基因的注释是列出酶的编码基因，并将其分为3个水平（level 1,level 2, level 3）。使用R中的vegan包对微生物物种和功能基因组成进行NMDS分析，并用线性回归评估了微生物类群和功能基因与恢复年限和生态系统功能的关系。
结果
1 鸟枪法宏基因测序结果
鸟枪法宏基因组测序总共产生了大约2.27亿个序列，平均每个样本约1500万个。在所有序列中，2.81%的序列未能通过质量控制，2.71%的序列既未鉴定为rRNA也未鉴定为蛋白，6.61%的序列鉴定为rRNA, 20.8%的序列鉴定为带注释的蛋白，67.1%的序列鉴定为未知蛋白。这一比例与其他土壤宏基因组研究报告的比例相似。
2 微生物类群和功能基因丰度
为了了解微生物类群和功能方面的变化，我们分别基于物种和功能基因组成计算了成对样本之间的Bray-Curtis距离，并使用NMDS可视化。如图1a所示,基于物种组成的β-diversity模式通常沿着恢复年限从6年到31年过渡,这是与先前发表的基于16 s rRNA基因扩增子测序的微生物群落特征比较一致。放线菌门、酸杆菌门，拟杆菌门, 疣微菌门, α-变形菌纲, δ-变形菌R2纲和γ-变形菌纲的相对丰度和样品排序轴有显著相关性(FDR=0.004-0.016，R2=0.52- 0.81)(图1 a和c), 放线菌和拟杆菌门在恢复早期丰度更高，而酸杆菌门在恢复后期丰度更高。微生物类群和功能基因和Avera等(2015)测定的生态系统功能参数也存在相关性。具体来说，其中总微生物生物量、底物诱导呼吸、NH4+、CH4和N2O的排放速率与微生物群落结构均显著相关(FDR = 0.0053-0.017, R2 = 0.45-0.76)(图S1a)。恢复后期，总微生物生物量和底物诱导呼吸普遍较高。相比之下，土壤NH4+浓度、CH4和N2O的排放速率在恢复初期较高，但CH4和恢复年限的关系在很大程度上是由未采矿样地CH4的高负排放(消耗)驱动的。
图1 基于NMDS的微生物群落的改变。(a) 物种组成，(b) 功能基因组成，(c) 主要的门，(d) 功能基因1级分类
然而，基于功能基因组成的排序图则呈现出不同的模式(图1b)，未采矿样地与22年恢复样地更为相似，并且偏离了随着恢复年限变化的总体趋势。某些一级（level 1）功能基因相对丰度的变化与排序轴显著相关(FDR=0.002-0.034, R2=0.47-0.88)，包括氨基酸及其衍生物(AAD)，细胞分裂与细胞周期(CDCC)，细胞壁与荚膜(CWC)，辅酶因子、维生素、辅基、色素(CVPP)，脂肪酸、脂类和异戊二烯类（FLI），氮代谢(NM)，核苷和核苷酸(NN)，噬菌体、噬菌体、转座因子、质粒(PPTP)，蛋白质代谢(PM)，呼吸(Res)，应激反应(SR)和毒性、病毒和防御（VDD）（图1b和d）。PPTP、SR和VDD随着恢复年限的增加而增加，而CVPP、CWC和FLI则减少。未采矿区Res含量较高，而AAD、CDCC、NM、NN和PM丰度较低。生态系统功能方面，总微生物生物量、底物诱导呼吸和CH4通量与功能基因谱的相关性接近显著(FDR=0.049-0.054, R2= 0.47-0.59)，未采矿区域总微生物生物量、底物诱导呼吸和CH4消耗量较高(图S1b)。
3 更高级别分类群的变化模式
根据与MG-RAST数据库序列的相似性，将97.64%的序列分类为细菌，0.59%分类为古生菌，1.61%分类为真核生物，0.02%分类为病毒。主要微生物类群或变形杆菌类群为α-变形菌纲, 放线菌和β-变形菌纲，在所有注释分类中分别占34.1%,18.5%和12.5%的 (图2)。鸟枪法宏基因组数据中酸杆菌门的丰度(6.77%)低于在16 s rRNA扩增测序的丰度(21.5%),而α-变形菌纲在这两种测序方法中均丰富。
相对丰度大于0.5%的多个类群在门和变形菌纲水平上随恢复年限的变化而变化(图2)。放线菌在5年样地更为丰富，而α-变形菌纲在未采矿的参考样地更为丰富。一般来说，恢复早期，拟杆菌门的相对丰度较高，而后期酸杆菌门的相对丰度较高。为了进一步检验这些趋势，我们采用线性回归方法量化了不同恢复年限(6-31年)的微生物类群差异的显著性(图2和图S2)。放线菌的相对丰度沿着恢复年限从27.1%（6年）下降至13.2% （31年）(FDR=0.032,R2=0.59)，而酸杆菌门的相对丰度从4.0%（6年）上升到11.2%（31年）(FDR= 0.047,R2 = 0.52)(图2)。在丰度较低的类群中，广古菌门, 产水菌门, 硝化螺旋菌门, 热袍菌门, 脱铁杆菌门，Zeta-变形菌纲都随着恢复年限的增加而增加(FDR= 0.015-0.047,R2=0.52-0.72),对Zeta-变形菌纲和硝化螺旋菌门的影响最大(图S2)。在占优势的α-变形菌纲中，我们也分析了这类细菌的目这一分类水平的变化(图S3)。随着恢复年限的增长，尾杆菌目和鞘瘤菌目的相对丰度降低(FDR = 0.0027-0.047, R2=0.43-0.72)，而红螺杆菌目的相对丰度显著增加(FDR= 0.0027, R2=0.69)。
图2 细菌的门或者变形菌门内的类群随着恢复时间的变化
4 功能基因变化模式
在Subsystem数据库的基础上，将功能基因分为21个一级分类。主要类别是基于集群的子系统(CBS), 碳水化合物(CH), 蛋白质代谢(PM), 氨基酸及其衍生物(AAD)分别占注释基因总数的14.2%、11.8%、10.4%和10.3%(图3)。在所有功能基因分类中，毒性、病毒和防御（VDD），应激反应(SR), 噬菌体、噬菌体、转座因子和质粒(PPTP), 次生代谢(SM)在恢复后期更为丰富(图3)。光合作用基因在6年恢复期的相对丰度较高，而未采矿样地的钾代谢和芳香化合物代谢编码基因(MAC)相对丰度较高。其中，PPTP、SR、VDD、SM和膜转运(MT)的相对丰度随恢复年限增长而增加(FDR=0.035-0.077，R2=0.44-0.62)，FLI和CVPP的相对丰度下降(FDR=0.012-0.040，R2=0.53-0.73)(图3和图S4)。在变化显著的类别中，恢复年限对FLA和SR的变化影响最大。然而，需要注意的是，在恢复年限时间序列图中观察到的某些类别(例如CVPP、FLI和MT)的显著斜率在未采矿样地中并不适用(图3)。
图 3 功能基因的 1级分类随着恢复时间的变化
功能基因类别与生态系统参数之间的关联分析表明，核苷类和核苷酸(NN)与总微生物生物量显著相关(FDR=0.033，R2=0.58)，VDD与底物诱导呼吸显著相关(FDR=0.033，R2=0.57)(表S1)。在2级分类中，显著下降的基因包括: 丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸，氨基糖，解毒，单糖，NAD和辅酶ii，磷脂，RNA的处理和修饰。显著增加的类别包括: 发酵，氧化应激，多糖，噬菌体、原噬菌体，程序性细胞死亡和毒素-抗毒素系统，冷休克，致病岛，对抗生素和有毒化合物的耐药性和转座。(FDR=0.020-0.058，R2=0.47-0.66)(图S5)。
图 4 与氮循环相关的微生物功能群、属和功能基因随着恢复时间的变化。(a) AOB, NOB 及其主要的属，(b) 氮循环相关的主要功能基因
5 与氮循环相关的变化
为了研究恢复造林对微生物氮循环的潜在影响，我们进行了更有针对性的分析，重点关注影响氮转化的微生物类群的相对丰度和功能基因。在硝化过程中，随着恢复年限的增加，硝化细菌(AOB)相对丰度从0.61%增加到0.97%，硝态氧化细菌(NOB) 相对丰度从2.5%增加到3.3% (FDR = 0.050和0.047, R2 = 0.41和0.47)。然而，NOB的相对丰度在未采矿样地进一步增加到4.2%，而AOB在31年恢复年限最高，在未采矿样地下降到0.63%(图4和图S6)。微生物功能群内部还存在额外的复杂性，特定的类群随着恢复时间的推移而呈现不同的趋势。例如，在氨氧化细菌中，硝基单胞菌、亚硝化螺菌属和亚硝基球菌(AOB)随着恢复年限显著增加，相对丰度和效应大小相似，但在未采矿样地均不丰富(图4a和图S6)。相反，Nitrosopumilus (最丰富的氨氧化古菌(AOA))在不同恢复年限间没有发生显著变化，但从采矿后恢复样地0.0074%增加到未采矿样地的0.020%(图4a)。
在亚硝酸盐氧化菌中，硝化菌的相对丰度 (FDR=0.050，R2=0.43)随着恢复年限从2.5%显著增加到3.2%，在未采矿样地进一步增加到4.1%。同时，在6 ~ 31年的采矿恢复样地，硝球菌的丰度也从0.069%显著增加到0.11% (FDR = 0.0097, R2 = 0.68)，但在未采矿样地，平均丰度仅为0.095%(图4a和图S6)。总的来说，硝杆菌是NOB的优势菌群，其数量通常比其他菌群多一个数量级，因此其数量的丰富程度主要驱动了NOB的总体格局。功能基因中，硝酸盐还原酶(EC 1.7.99.4)也称为亚硝酸盐氧化还原酶(nitrite oxidoreductase，同时催化硝化和反硝化)在早期更为丰富(图4b)。
6 与甲烷氧化相关的变化
甲烷氧化菌代谢甲烷获取碳和能量，在属水平上占所有分类序列的1.1%，而产甲烷菌在厌氧呼吸过程中利用二氧化碳作为电子受体产生甲烷，仅占序列的0.12%。所有特征的甲烷氧化菌都随着恢复时间的增加而显著增加了大约两到三倍(FDR=0.0013-0.016，R2=0.49-0.78)(图5a和图S8)。未采矿样地Methylocella、甲基胞囊菌属和甲基弯曲菌属的相对丰度最高，分别为0.71%、0.27%和0.28%。相比之下，甲基杆菌属和甲基球菌属的丰度在恢复31年的样地最高，分别为0.095%和0.20%(图5a)。然而，Methylocella、甲基胞囊菌属和甲基弯曲菌属占所有甲烷氧化菌的76.7%，因此它们主要驱动了整体的甲烷氧化菌趋势。产甲烷菌中，热杆菌属、Methanoculieus、甲烷螺菌属、Methanoregula和甲烷八叠球菌属均随恢复时间的增加而显著增加(FDR=0.0024-0.018，R2= 0.47-0.70)，但其丰度远低于产甲烷菌。Methylocella、甲基胞囊菌属和甲基弯曲菌属的相对丰度变化均与CH4的排放率呈显著负相关(FDR=0.00002-0.0002, R2=0.76-0.85)(表S6)。
在参与甲烷循环的功能基因中，未检测到甲基辅酶M还原酶基因(参与甲烷生成的主要基因)，说明甲烷净通量主要依赖于甲烷氧化菌的变化。与甲烷单加氧酶相关的基因，即甲烷营养过程中代谢甲烷的功能基因，并没有随着恢复时间的推移而发生显著的变化。然而，综合所有四种类型，它们确实从恢复31年样地的0.013%急剧增加到未采矿样地的0.029%(图5b)，这进一步支持了甲烷消耗只活跃于未采矿的地区。此外，甲烷单加氧酶基因相对丰度的变化与CH4的排放速率显著相关(FDR=0.0012-0.0036，R2=0.49-0.65)(表S7)。
图5 与温室气体排放相关的微生物属和功能基因随着恢复时间的变化。(a) 甲烷氧化菌和产甲烷菌，(b) 与甲烷和NO产生相关的主要功能基因
讨论
1 微生物类群的变化
基于鸟枪法宏基因测序的β多样性模式和微生物类群的变化通常和之前那些使用16S rRNA 基因扩增测序的结果相似。基于样本之间的Bray-Curtis距离，微生物群落相似性与恢复年限有关，随着恢复时间的增加，群落结构与未采矿样地土壤的相似性越来越大(图1a)。鸟枪法宏基因组方法，可能提供了关于相对丰度更准确的数据，没有潜在的扩增误差，验证了之前发表的结论。最强烈的变化是酸杆菌门和硝化螺旋菌门增加一倍和放线菌丰度几乎减半。这些变化支持了之前描述的从富营养性向贫营养性的转变。总而言之，恢复年限解释了这些类群中超过50%的变异，这表明生态系统的发育与富营养性向贫营养性的转变存在很强的关联。然而，重要的一点需要注意，在恢复年限时间序列图中观察到的几个重要类群变化趋势在未采矿样地中并不适用。因此，有必要进一步研究这些群落在未来数十年之后的持续变化。
占优势的7个α-变形菌目被恢复年限解释的变异相似(43.3-71.8%)，不过柄杆菌目菌和鞘脂单胞菌目减少，而红螺杆菌目增多。众所周知，鞘脂单胞菌目与植物相互作用并利用根部分泌物，因此，恢复后期树冠的发育和草本盖度的减少可以解释鞘脂单胞菌目的减少。在其他系统中，根系生物量随着草本的优势度降低而减少，与在矿质层中较深土壤的树木生根相比，草本生根发生在离地表更近的地方。与之相反，红螺杆菌在森林土壤中比在草原土壤中更为丰富，并且通常营养不良，并且与不稳定的土壤养分如溶解氮和有机碳呈负相关。由于根际通常是营养丰富的区域，向深根植被的改变也可能减少本研究取样的表层0-10cm土壤中易分解的营养物质含量。这种转变也将进一步解释浅层土壤中贫营养微生物随恢复时间的增加。总体而言，我们的研究结果支持在森林生态系统恢复过程中，由草为主植被向树为主植被过渡和土壤养分变化是驱动微生物群落变化的重要因素，这在次生演替过程中也是如此。
2 碳循环
功能基因相对丰度的变化也表明，森林演替过程中土壤微生物群落响应的关键是资源可利用性和微生物的相互作用。在碳代谢方面，光合作用相关基因在恢复6年的样地最为丰富，这里未发育的树冠使大部分光照到达土壤表面。在异养生物中，功能基因的变化也表明，随着时间的推移，土壤微生物群落正在适应从易分解到难分解的C类化合物的转变。例如，参与多糖代谢的基因相对增加，而参与单糖代谢的基因相对减少，其变异性分别为64%和47%，这可以用恢复年限来解释(图S5)。未采矿样地参与芳香族化合物代谢(MAC)的基因最为丰富(图3)，其中有机碳含量也最高。随着恢复年限的增长，参与2级细胞分裂类别的基因数量减少(图S5)也支持了从富营养性向贫营养性的转变，因为贫营养生物往往具有较低的周转率。此外，添加N后从贫营养类群向富营养类群的转变会导致呼吸速率下降，这与我们之前的观察一致，即恢复年限与这些样地的呼吸速率增加有关。呼吸作用的增加可能是由于难分解碳库的贫营养生物利用得更多，而难分解碳库是土壤有机碳的主要组成部分。
3 生物的交互作用
土壤是噬菌体、噬菌体和转座子的库，而这些移动的遗传元素可以塑造微生物群落。例如，标记为转座子的序列在这个恢复时间序列中增加了20%以上，这可能是对群落压力的反应，如营养缺乏或温度变化(McClintock, 1984;Capy等，2000)。此外，转座子在细菌间分解代谢通路的构建和传播中是必不可少的，并使细菌群落能够更快地适应新的外来生物。因此，PPTP类基因的增加也可能反映了细菌群落对植被输入新化合物的变化出现的适应。
在这个恢复时间序列中，涉及毒力、疾病和防御(VDD)的基因丰度增加了约25%，这表明种间微生物竞争也随着恢复年限的增长而增加。细菌在面临营养竞争时可以增加抗生素和细菌素的产量。在VDD类中，毒素和超抗原类基因的相对丰度虽然较低，但随着恢复年限的增长，其相对丰度大约增加了两倍，而对抗生素和有毒化合物的耐药性增加了约20%，这与竞争加剧是一致的。随着恢复时间的增加，与交互作用相关的功能类别的变化有47%与生态系统的发育密切相关，无论是合作的还是竞争，微生物之间相互作用也增加。这一结果与之前在这些样地报道的相互作用网络复杂性的增加和微生物活动速率的增加是一致的。
4 氮循环
氮循环微生物丰度的变化反映了整个氮循环的变化以及功能群内部的变化。例如，随着恢复年限的增长，AOB和NOB都增加了30%，这表明向增加硝化细菌的转变。然而，AOB在恢复31年的样地达到峰值，而AOA在未采矿样地最高。随着恢复年限和土壤C:N的增加，AOB-AOA发生了变化，这与之前的报道一致，AOB通常生活在铵态氮丰富的环境中，而AOA对铵态氮浓度的依赖性较小。虽然未采矿样地的总氮最高，但随着时间的推移，土壤中的氮往往会嵌入复杂的有机化合物中，此后，土壤氮的生物利用度高度依赖于土壤有机质中氮的解聚。在NOB中也发生了类似的类群变化。硝化细菌、硝化球菌属和硝化螺旋菌都随恢复时间的增加而增加，但硝化细菌是迄今为止占主导地位的N氧化微生物，特别是在未采矿样地，其平均丰度比其他任何微生物类群高10倍以上。硝化细菌与硝化螺旋菌的亚硝酸盐亲和力较低，说明硝化细菌更适应亚硝酸盐浓度较高的环境。
与微生物类群的变化相比，大多数参与N循环的功能基因并没有随着恢复时间的增加而发生显著变化(图4b)。亚硝酸盐氧化还原酶在恢复早期普遍较高，但难以解释这一现象，因为它在两个方向代谢亚硝酸盐-硝酸盐转化。在反硝化过程中，亚硝酸盐还原基因一般随恢复年限的增加而减少(图4b)，这意味着恢复早期反硝化活性更高，这与之前的研究一致。然而，这些变化中很少有显著的，反硝化可能与许多因素有关，包括土壤压实度、pH和随矿质层土壤发育恢复而变化的养分有效性。在这些地点，没有收集关于土壤压实的数据，亚硝酸根还原基因与测得的养分或水分之间也没有显著的关联。
5 甲烷循环
除未采矿样地外，所有采矿后恢复样地的甲烷氧化菌和甲烷单加氧酶基因相对丰度的下降，与Avera等人(2015)之前观察到的所有采矿样地甲烷消耗量的减少相一致。因此，甲烷消耗的缺乏似乎是由于甲烷氧化菌种群较低的恢复，而不仅仅是活动速率的变化。众所周知，土地利用可以改变甲烷氧化菌的群落，而森林砍伐过的土壤可以从净汇变成甲烷的净源。
甲烷氧化菌分为I型(如甲基球菌属和甲基杆菌属)和II型(如甲基弯曲菌和甲基孢囊菌属)，我们观察到从I型到II型随恢复年限的变化趋势与之前的研究一致。总的来说，II型甲烷氧化菌占主导地位(占甲烷氧化菌的77%)，并且对恢复年限有较大的响应。因此，它们可能是甲烷单加氧酶基因丰度变化的主要驱动因素，因为它们在未采矿样地都达到了相对丰度最高的水平。同样，II型甲烷氧化菌的相对丰度与其他恢复造林样地的甲烷氧化具有显著的相关性。
虽然所有的II型甲烷氧化菌都随恢复年限的增长而显著增加，但它们在未采矿样地的相对丰度仍然高得多。因此，甲烷氧化菌群落才刚刚开始恢复，可能需要31年以上的时间才能与未受干扰的森林土壤相媲美。生活在低甲烷浓度下的甲烷氧化菌极易受到干扰，而土壤甲烷库在土地利用变化后的恢复时间此前估计为> 100年。此外，此外，甲烷氧化菌向非活性状态的转变和对N循环的抑制可能进一步影响甲烷氧化的恢复。控制土壤甲烷汇恢复的具体因素大多是未知的，但它们很可能受到复杂过程的调控，这些过程不仅包括非生物因素，还包括与产甲烷菌和其他生物的相互作用。
6 宏基因组和生态系统过程的联系
我们的研究结果表明，生态系统过程与宏基因组相关部分的变化之间关系的强度取决于所研究过程的类型。在N循环中，相关的类群或功能基因与土壤NH4+、NO3 -或N2O通量的测量值之间只有一个略微显著的关系。相比之下，甲烷氧化菌类群、甲烷单加氧酶基因和CH4通量密切相关。例如，图5中三种II型甲烷氧化菌都能解释75%的CH4排放率的变异，而甲烷单加氧酶基因能解释49%的变异(表S6和S7)。相比之下，NH4+、NO3 -浓度或N2O通量中< 40%的变异可以用任何相关的微生物类群来解释(图4，表S3)。在功能上，N2O排放速率的变异中有45.7%可以用NorE来解释，而其他脱氮基因的解释的变异< 12%(表S4)。
生态系统过程往往很难与微生物群落结构或功能基因丰度的变化联系起来，这可能是更复杂循环过程的复合。例如，N循环，特别是反硝化，包含更多的生物地球化学转化和途径，比CH4循环更广泛地分布在系统发育类群中。此外，在本研究中，这些样地观测到的CH4排放速率的变化幅度或“信噪比”远高于N循环的变化。考虑到所有这些因素，在N循环中发现宏基因组与生态系统过程之间的关联比在CH4循环中更难，这并不令人惊讶。
随着测序能力的不断提高，宏基因组与生态系统过程之间的关系可能会随着样本量的增加而得到改善。然而，这可能还不够，Hall等人(2018)概述了将微生物群落变化与生态系统功能直接联系起来所面临的挑战，特别是在复杂的循环中，而且没有考虑中间的机制步骤。如他们所提议的，以个别过程为重点的更全面的实验框架将能更好地了解复杂过程中的联系。根据我们的结果，轻松识别出微生物组和生物地球化学循环之间的关系可能与个别转换的数量有关，这一转变导致在一个特定的环境，净的通量，所涉及的微生物系统发育多样性和变化的量级被观察到。同样重要的是，宏基因组学方法偏向于细菌，因为它们在土壤DNA库中占主导地位。因此，土壤生物地球化学过程的其他重要介质如真菌、土壤动物和植物根系生物量没有很好地结合起来。为了更好地理解土壤群落、基因和过程之间的关系，未来的研究必须增加样本量，更好地整合土壤真核生物，更精确地针对特定的生物地球化学过程。
总之，这项工作描述了生态系统扰动后土壤宏基因组的分类和功能变化，阐明了扰动后微生物恢复的可能机制及其潜在的生态含义。微生物类群和功能基因的变化均表明，从易分解碳向难降解碳的转化是驱动微生物代谢变化的重要因素。资源的转移可能导致从共生性向寡养性的转变，并增加了微生物之间的竞争。此外，微生物不仅在群落水平上表现出演替模式，而且在功能群内部也表现出演替模式，如氨氧化细菌中AOB和AOA之间的转化以及亚硝酸盐氧化菌中硝化细菌、硝化螺旋菌和硝化球菌之间的转化。类群和功能基因的丰度表明，森林土壤中甲烷氧化菌的恢复时间极长，这是森林土壤在31年后没有以甲烷汇的形式恢复的原因。在两个关键的生物地球化学循环中揭示的宏基因组与生态系统参数之间的不同关系表明，这些循环的复杂性和所观察到的过程速率变化幅度是确定完整元宏基因组数据集与生态系统功能之间广泛关系的限制因素。
评论
土壤微生物作为生态系统过程重要的参与者和调控者，对干扰生态系统的恢复起着至关重要的作用。然而，微生物群落和其功能基因与生态系统过程的联系目前还未清楚。本研究利用高通量测序技术-鸟枪法宏基因测序，在一个采矿后进行森林恢复的时间序列样地，采集土壤并测序，和一些生态系统过程参数相关联。研究结果表明。该技术手段可靠，但也存在一定局限性，微生物群落和功能基因对一些生态系统过程具有很好的预测，如碳循环和甲烷循环，而对氮循环的预测结果并不好。另外，土壤中的真菌，动物和植物根系对生态系统过程的影响也很关键，下一步的研究应该将这些因素也考虑进去，并精确确定某一类生态系统过程，以更好地理解土壤微生物、基因和生态系统过程的联系。
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