科研 | Water Research：高质量处理废水仍会引起自然微生物群落和intI1基因丰度的显著变化

编译：萍水相逢，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

本文通过中试实验评估了高质量处理的废水 (HQWR)对淡水细菌的影响。高质量处理废水在农业中被重复利用，而实验所用淡水细菌几乎未受人为污染。

本文主要对比了处理组和对照组之间细菌群落丰度和组成及抗性基因丰度之间的差异性。2个处理组为在未受污染的湖水和高质量处理的废水中加或不加头孢噻肟(cefotaxime))，对照组为来源于未受污染的湖水。

结果显示：(1) 不添加头孢噻污的对照组tetA、arsB、czcA和intI1基因的丰度显著高于对照组，而添加了头孢噻肟的对照组无显著差异。而与carbapenems、b-lactams、fluoroquinolones和 macrolides抗生素相关的抗性基因未被检测到。(2) 处理组中可获得的高营养更有利于细菌的生长，尤其是Acinetobacter spp. 和Pseudomonas spp.在培养22天后有明显的富集。处理组中头孢噻污的存在引起Acinetobacter spp.细菌的富集，表明抗性形式可能具有除bla_CTX-M, bla_OXA和bla_KPC以外的抗性基因。

尽管结果是来自连续培养的中试实验，但仍应引起注意，人们仍需规范再生水在农业中的使用，因为即使是经过高质量处理的废水也可能对细菌群落的组成合抗性基因的扩散产生不良影响。

论文ID

原名：High-quality treated wastewater cause sremarkable changes in natural microbial communities and intI1 gene abundance

译名：高质量的处理废水会引起自然微生物群落和intI1基因丰度的显著变化

期刊：Water Research

IF：7.05

发表时间：2019.7.22

通讯作者：Jèssica Subirats

通讯作者单位：西班牙赫罗纳大学

材料与方法

1 韦尔巴尼亚的城市废水污水处理厂 (UWTP)

韦尔巴尼亚市的UWTP废水主要来自于居民生活污水和医院污水。而污水处理厂的污水处理过程主要包括：1) 液体和固体的机械分离；2) 生物(活性污泥)和化学(由氢氧化钙和阴离子聚丙烯酰胺富集的多氯铝)处理; 3) 以及最后一步的氯化消毒处理。水样品在未进行氯化消毒处理前收集后4℃储存以便后续处理。水体过0.45μm和0.2 μm的滤膜以去除由UWTP带来的微生物。

2 实验设计

实验是在一个由9个独立反应器组成的一级连续培养系统中进行的，该反应器包含1 cm²的塑料载体（Anox Kaldnes，挪威），用于提供易于提取的生物膜样品。3个不同的处理一同运行，每个处理3个平行。

1) 对照组 (CT)只有来自Mercurago泻湖的水。该泻湖位于意大利北面一个自然保护区的一个未直接受到人为排污的小湖。在使用前对水进行高压灭菌，以防止微生物在不改变整体营养成分的情况下在饲养池中再生；

2) HQWR由高压灭菌后的湖水和过0.45 μm 和0.2 μm 滤膜后的UWTP的水1:1等比例混合而成；

3) 第3个处理组的HQWR和第2个处理的HQWP一样，只是该处理价了终浓度未5 mg·L^-1的cefotaxime (HQWR+AB)。加入cefotaxime的目的在于模拟用再生水灌溉农业后重现严重的抗生物污染的情况。

实验中的微生物群落主要由Mercurago泻湖中的浮游微生物和生物膜微生物组成。浮游微生物通过收集表层1.5m和底层1m左右的水体，收集的约10L水体6℃避光保存后立即带回实验室。收集的水体过100 μm的滤膜以去除动植物碎屑和浮游动物。生物膜微生物主要收集生长在泻湖中的鹅卵石表面生长的生物膜（表生生物膜）获得。约50 mL的富有微生物和生物膜微生物的悬浮液，用于实验对照组和处理组的微生物菌种进行接种。在接种之前，菌种在12℃下培养4天以使微生物群落稳定并在塑料载体上形成生物膜。稳定后，通过多通道蠕动泵向3个处理 (CT、HQWR和HQWR+AB)中不断泵入新鲜培养基使恒化器以连续模式运行。由于cefotaxime在水中的非生物降解，在实验期间HQWR+AB的培养基每三天更换一次以保持cefotaxime的浓度稳定在5 mg/L。将恒化器在恒温气候箱 (12℃)下培养22天，培养期间用无菌空气持续的向恒化器中通入空气。

3 采样及样品处理

每个处理采集150 mL的培养液以检测器营养物浓度并评估细胞残留量。同时收集接种物样品，每2天收集5 mL以量化实验过程中原核细胞的数量，样品用福尔马林固定，并于4℃保存，直到通过流式细胞仪进行分析。分别在第1、14和22天从3个处理中收集250 mL的水样以检测其中的抗生素残留。同时每隔2天从恒化器中收集2 mL的液体以检测实验过程中的抗生素浓度。水样通过0.45 μm滤膜过滤后于-80℃保存。

处理前后的ARGs和MRGs的细菌组成和丰度的测定。在实验开始之前，收集50 mL的接种液；实验结束后 (22天后)，收集每隔处理的水样和生物膜样品。水样过0.22 μm的滤膜后储存在-20℃直到DNA的提取。而生物膜样品则在6000 rpm下离心15 min取沉淀存于-20℃下直到DNA的提取。

在实验之前，3种处理的培养基中的N、P通过UV-VIS分光光度计测量；TOC采用高温燃烧法测量。分析详情见http://www.idrolab.ise.cnr.it/en/。实验中流出的废水的理化性质在Acqua Novara.VCO实验室测量。包括COD、BOD5、重金属浓度、抗生素浓度、有机及无机污染物、N元素、各种物理化学参数以及微生物参数。

4 抗生素分析

所有的抗生素标准品均购于Sigma，纯度>90%。通过将10 mg固体参考标准品溶解在10 mL适当的溶剂中，制备浓度为1000 mg / L的单个储备标准品，同位素标记的内部标准品和替代标准品溶液。

水样中抗生素的浓度通过固相萃取 (SPE)进行预浓缩。简而言之，水样一次过1.0 mm和0.45 mm的滤膜。样品的pH通过加入0.1 M 的HCl和4%的EDTA调节到3。HLB柱使用前先用5 mL的MeOH和5 mL的HPLC级水调节，而后100mL的水样用HLB柱进行提取。为了进行抗生素分析，柱子用6mL的甲醇洗脱后再进行温和的氮吹以蒸发多余的液体，然后用1 mL的甲醇：水 (1:1)的混合液进行重悬。

将包含所有同位素标记的标准品10 mL浓度为1 ng/mL混合物作为内标添加到水提取物以及实验中从每个恒化容器中收集的水样中。通过使用配备Acquity BEH T3色谱柱（50 mm，内径2.1 mm，粒径1.7 mm）的四元泵系统的UltraPerformance液相色谱（UPLC）系统进行色谱分离，分析所有样品。UPLC系统与具有Turbo V离子喷雾源的三重四极杆线性离子阱质谱仪（Applied Biosystems; Foster City，CA，USA）耦合。为了进行准确的定量，我们使用同位素标记的标准品通过内部校准来计算回收率和浓度。

5 细菌丰度测定及DNA提取

原核细胞的浓度则使用Accuri C6流式细胞仪（BD Biosciences，USA）进行评估。所有的DNA用Ultraclean Microbial DNA isolation kit(Qiagen, USA)进行提取。而提取后的DNA浓度用Qubit2.0进行检查。

6 抗性基因定量

与carbapenems相关的3个抗性基因 (bla_CTX-M, bla_OXA和bla_KPC)及5个主要与β-lactams、fluoroquinolones、tetracyclines、sulfonamides 和macrolides相关的抗性基因 (bla_TEM、qnrS、tetA、sul2和ermB)，包括2个MRGs、czcA (镉、钴和锌抗性基因)和arsB基因 (砷抗性基因)以及一个整合基因intl1通过qPCR检查。每个目标抗性基因都通过16S rRNA基因进行标准化。

7 高通量测序及数据处理

为评估在不同处理条件下的细菌群落组成，我们利用Illumina MiSeq System测序平台检测了16S rRNA基因。原始序列用USearch v9 分析，并通过拼接和质量控制，共得到1,300,000条序列。相似性> 97%的序列划分为一个分类操作单元 (OTU)，剔除掉只包含一条序列的OTU以免多样性被夸大。每个OTU的代表序列利用PyNAST软件进行比对并在QIIME中完成OTU的分类。每个样本的测序深度范围为3880 - 83,337个序列。最低测序深度的样本（3880个读数）对应于HQWR和HQWR + AB处理的培养基，进一步的分析中删除。从OTU表中筛选出与古细菌相关的OTU（76个读长，2％），藻类叶绿体（102个读长，3％）和未分类的OTU（217个读长，6％）。我们最终所有样本中的1.165.924序列归类到3049个细菌OUT中。该研究的原始测序数据已保存到NCBI数据库中，登录号为：PRJNA521809

8 数据分析

目标基因 (ARGs、MRGs、intI1和16S rRNA gene)丰度的差异性用two-way ANOVA分析，其中处理 (CT、HQWR和HQWR+AB)和基质 (水和生物膜)作为固定因子。生物膜和水样中基因绝对丰度的差异性用one-way ANOVA分析，其中处理组(CT、HQWR和HQWR+AB)设定为固定因素。Kruskal-Wallis检验用于非正态分布的数据 (intI1和tetA)。水样中细菌丰度的差异性同样用one-way ANOVA分析。所有的分析均在R中实现。

对于群落组成分析，我们基于每个细菌分类群的相对丰度，使用BrayeCurtis距离构建相似矩阵。使用基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析（PCoA）对样本进行排序。在通过处理和底物对样本进行分组之后，基于分类学组成对群落之间的相似性进行了分析。使用相似度百分比的分析方法，计算了每个属对样品之间Bray-Curtis距离的贡献（SIMPER，Clarke，1993）。所有这些分析均在PRIMER-6统计软件包中进行。

结果

1 营养元素、抗生素及细菌丰度

第一天，处理组 (HQWR和HQWR+AB)N、P、S的浓度分别比控制组 (CT)的高20、15、3倍。相反，控制组中NH4+的浓度比处理组的高3倍，而控制组和处理组间TOC和有机N浓度相当 (见附表4)。

Cefotaxime仅在HQWR+AB水样中检测到，平均浓度为5.19 ± 0.03 μg·L^-1。抗生素浓度在实验期间有轻微的下降 (4.42 ± 0.29 μg·L^-1)。在实验开始之前，控制组(CT)和处理组 (HQWR、HQWR+AB)中细菌浓度分别为8.69 ×10⁵和 5.80 ×10⁵ cells· ml^-1。因为这些细胞来源于高压灭菌的泻湖湖水，因此无法存活。接种的细菌细胞浓度为8.12 ×10⁶ ± 6.55×10⁵ cells· ml^-1。

从第4天到实验结束，CT组平均细胞浓度维持在1.49 × 10⁶ ± 9.75 × 10⁵ cells· ml^-1，随时间变化不明显（One-way ANOVA，p=0.06）。然而， CT组的细胞丰度的均值显著低于HQWR（One-way ANOVA，p < 0.001）和HQWR+AB（One-way ANOVA，p < 0.001）处理组。在HQWR (细胞均值：3.63×10⁶ ± 1.18×10⁶ cells· ml^-1)和HQWR + AB (细胞均值：3.81×10⁶ ± 2.32×10⁶cells· ml^-1)处理中，细胞丰度没有显着差异（One-way ANOVA，p = 0.744），并且在整个实验期间几乎保持不变，除了在第20天浓度达到峰值。

图1三个实验组在培养时间期间悬浮细胞的浓度。细胞数用每个处理中三个平行的平均值表示 (±SD); CT：控制组；HQWR: 高质量处理的废水；HQWR + AB: 加入了头孢噻肟的HQWR

2 ARGs、MRGs和intI1基因丰度

在所有样品中，与头孢噻肟（bla_CTX-M、bla_OXA、bla_KPC），β-内酰胺类（bla_TEM），氟喹诺酮类（qnrS）和大环内酯类（ermB）相关的抗性基因始终低于检测限。所有测试的ARGs中，仅检测到sul2、tetA、intI1、arsB和czcA基因。所有这些基因在培养基和接种菌液中也检测到。特别是，sul2是在CT处理的进料培养基中检测到的唯一基因，而在处理组的进料培养基（HQWR和HQWR + AB）中也检测到了tetA和czcA，相对浓度范围为1.69 ×10^-3至1.35×10^-2copies·16S rRNA^-1。所有靶基因在接种物中均检测到，但浓度低于处理组的进料培养基中的浓度。

22天后，HQWR和HQWR + AB处理组间intI1基因的相对浓度相近，并且显着高于CT组（Kruskal-Wallis检验，p = 0.010）。但是，intI1丰度在所有底物（水/生物膜）上没有显著差异（Kruskal-Wallis检验，p = 0.119）。sul2基因的相对丰度既不受处理（Two-way ANOVA，p = 0.214），也不受底物（Two-way ANOVA，p = 0.37）的影响。尽管如此，与生物膜样品相比，HQWR + AB处理对水样品中sul2的浓度影响更为明显。相关因素“处理”和“底物”之间的显着相互作用进一步证实了这一观察结果（Two-way ANOVA，p = 0.043）。在所有生物膜样品中均未检测到tetA，但仅在HQWR和HQWR waterAB的水样品中检测到，且处理之间无显著差异（Kruskal-Wallis试验，p = 0.942）。

当比较与重金属相关的抗性基因（czcA和arsB）的相对和绝对丰度时，得到了不同的结果。czcA基因的相对丰度既不受处理（Two-way ANOVA，p = 0.098），也不受底物（Two-way ANOVA，p = 0.148）的影响。在所有生物膜样品中均检测到arsB基因，但仅在从HQWR和HQWR + AB处理收集的水样中检测到了arsB基因，两种处理间无明显差异（Two-way ANOVA，p = 0.114）。在HQWR和HQWR+ AB处理之间，czcA和arsB基因的绝对浓度相似，并比CT组至少高出一个数量级，并且与底物无关。但是，只有生物膜样品中的czcA基因和水样中的arsB基因显示出显著着差异（分别为p = 0.009和p = 0.001）。

图2 培养22天后抗生素/抗金属的抗性基因及intI1基因的相对丰度。CT：控制组；HQWR: 高质量处理的废水；HQWR + AB: 加入了头孢噻肟的HQWR

3 细菌群落组成

接种菌的细菌群落主要由拟杆菌属（48.41±11.33％）β-变形杆菌（17.75±4.03％）和放线菌属（11.85±1.97％）组成（图3）。22天后，浮游生物和生物膜细菌群落则主要由β-变形杆菌（42.57±18.74％; 25.52±2.73％），疣微菌门（28.08±14.17％; 19.63±5.31％）和Alfaproteobacteria（13.77±10.26％; 13.48± 1.39％）的组成。

用Bray-Curtis相似距离评估了处理方式和底物类型对浮游生物膜和生物膜细菌群落组成的影响（图4）。主坐标分析（PCoA）表明，底物类型可解释40.4％的变异（PERMANOVA，p< 0.001）（图4A）。在控制条件下，细菌群落的组成聚集在一起，并与处理组的细菌群落显著分离（HQWR（p < 0.001）和HQWR+ AB（p < 0.001）），而与底物类型无关（图4A）。尽管如此，来自HQWR和HQWR + AB的细菌群落在组成上也显示出显差异（p = 0.004）（图4B）。

CT和处理组（HQWR和HQWR + AB）之间细菌群落组成的差异主要归因于不动杆菌属和假单胞菌属序列的相对丰度的变化，以及未分类的疣状微生物（图5）。不动杆菌属和假单胞菌属的序列分别占CT总体细菌群落的0.005±0.0％和0.28±0.29％，但在处理组中（HQWR和HQWR+ AB）增加到14.15±3.05％和13.39±6.54％。相反，与控制组相比，在处理组中，疣状微生物相关的序列的相对丰度降低了16.33％（图5；表1）

图3 培养22天后接种体、生物膜和水体中细菌在门分类水平下的群落组成。CT：控制组；HQWR: 高质量处理的废水；HQWR + AB: 加入了头孢噻肟的HQWR

讨论

本文的主要目的就是在控制条件下，探究HQWR对未直接受人类污染的水体细菌群落结构组成和丰度的影响。HQWR对大多数基因（tetA，intI1，arsB和czcA）的丰度具有重大影响。但是，在HQWR中添加5 mg·L^-1的头孢噻肟（第三代头孢菌素）不会对所分析基因的丰度造成严重影响，因为与第三代头孢菌素（bla_CTX-M，bla_OXA和bla_KPC）相关的基因均未在任何样品中检测到。这些结果表明，尽管选择的细菌对头孢噻肟耐药，但在我们的实验条件下暴露于5 mg·L^-1头孢噻肟中可能不会导致对头孢噻肟的耐药性的新生突变。

先前的研究已经强调，在特定环境下，抗生素的亚抑制浓度可能有助于在特定细菌群落中维持和选择耐药细菌，从而改变其组成。在HQWR中测量的属于主要抗生素家族的53种抗生素的浓度低于检出限（范围为3.6 ng·L^-1至36 ng·L^-1，见附表6）。具体而言，所分析的四种四环素抗生素的检出限为8.1至25.2 ng·L^-1。在这点而言，暴露于HQWR的浮游生物群落中tetA基因相对丰度的增加表明，即使在非常低的抗生素浓度（< 25.2 ng·L^-1）下，四环素细菌抗性的维持和选择也可能发生。尽管如此，观tetA基因相对丰度的增加可能是在HQWR中存在的不同胁迫因素（包括营养负荷）的综合作用的结果。与对照培养基相比，代谢速率提高，HQWR中较高的营养物浓度可能有利于细菌群落内的HGT事件的发生。实际上，暴露于HQWR和含有低剂量头孢噻肟的HQWR中的细菌群落比暴露在对照培养基中的细菌群落显示出更高的生长速率，这可能是由于大量的不稳定营养素的存在。

图4 基于ARGs的相对丰度的Bray-Curtis相似性距离的PCoA排序分析。A图包括所有的处理组，而B图是不包括控制组的排序图。CT：控制组；HQWR: 高质量处理的废水；HQWR + AB: 加入了头孢噻肟的HQWR

最近的研究表明，在药物化合物的共同作用下，营养物质可能会诱导溪流生物膜中intI1基因的丰度增加。这些发现可能为暴露于HQWR的生物膜和浮游细菌群落中intI1基因的广泛存在提供了合理的解释。这些结果支持以下假设：即使细菌群落暴露于被认为可安全用于农业灌溉的高质量废水中，但intI1基因可表征人为污染的存在 (即intI1基因可作为人为污染的存在的替代物)。这尤其令人担忧，因为intI1基因通常与多个抗性基因连锁，因此有利于与抗生素和金属抗性相关的基因的共选择。在这方面，我们的研究还表明，HQWR也可能有利于MRGs的持久性，这可能是由于低浓度的金属引起的（附表1）。因此，如果ARGs和MRGs都位于质粒中的遗传平台（例如1类整合子）中，那么它在没有抗生素的情况下也可维持和选择细菌群落中的抗生素抗性。

我们还调查了浮游生物群落和生物膜群落之间适应的潜在差异。研究结果表明，浮游生物群落对环境压力的敏感性往往高于生物膜上的。生物膜群落的较高抵抗力可能是由于多糖的胞外基质赋予了其对环境危害的固有保护作用。尽管多糖生物膜基质的复杂结构使生物膜细菌对抗菌药物的敏感性比浮游细菌细胞低10至100倍，但它也为基因转移提供了良好的环境。除其他功能外，这一功能使细菌生物膜被认为是评估长期人为污染暴露对地表水中抗生素耐药性流行率的影响的合适生物传感器。

图5 三个实验组样品中的细菌群落组成。每个气泡的大小代表读长数所占的比例。水和生物膜样品聚在一起。CT：控制组；HQWR: 高质量处理的废水；HQWR + AB: 加入了头孢噻肟的HQWR

在水生生态系统中，环境因素在影响细菌群落组成方面起着关键作用。先前的研究表明，废水可以通过改变栖息地的理化特性和引入废水相关细菌来改变接收水域的微生物群落。在这里，我们证明了HQWR还可以显著改变从未直接暴露于人为污染的细菌群落组成。暴露在HQWR 22天后，浮游细菌和生物膜细菌群落均富集不动杆菌属和假单胞菌属细菌。此结果可能主要是由于培养基中存在的溶解性有机物（DOM）的化学特性不同。对照处理中的培养基是来自Mercurago Lagoon（意大利）的天然水，该水具有高比例的难溶有机碳，其中包括高分子量和结构复杂的化合物（例如腐殖酸和木质素）。处理后的废水富含不稳定的有机碳，有利于细菌的生长，尤其是在选择压力下（例如废水中的化学应激源）具有良好竞争性的细菌，例如不动杆菌属和假单胞菌属。此外，在HQWR中加入5 mg/L的头孢噻肟抗生素有利于不动杆菌属，这表明它们可能携带与头孢噻肟抗性相关的基因，而不是本研究中分析的那些基因（bla_CTX-M, bla_OXA和bla_KPC）。实际上，不动杆菌属携带与碳青霉烯类耐药性相关的不同基因，例如bla_VIM，blaIMP和bla_SIM，并容易获得对氨基糖苷类，氨苄青霉素，四环素，庆大霉素和妥布霉素的抗性。与不动杆菌属不同，假单胞菌属的细菌对头孢噻肟抗生素敏感，因为暴露于HQWR + AB处理的那些样品中它们的相对丰度降低了。

不动杆菌和假单胞菌属物种在暴露于HQWR的样品中富集是一个重要的结果，因为这两个属都包含与医院感染相关的几种对多药耐药的人类病原体。自从通过食用在废水回用的土壤中再生长的农作物将ARB和ARGs引入食物链以来，用于灌溉的废水可能会导致潜在的人类健康影响。

结论

本文研究结果表明，HQWR中新出现的污染物的存在和养分的可利用性可能对环境构成巨大威胁。具体而言，再生废水显著地增加抗性基因库以及水生环境细菌种群之间基因转移的可能性。此外，HQWR有利于不动杆菌和假单胞菌的生长。在浮游生物群落中，这两个属都包含多药耐药性机会病原体。尽管仍然存在许多知识空白，无法确定抗生素抗性从环境向人类传播的风险，但是将经过处理的高质量废水用于农业灌溉可能对人类健康构成直接威胁。从这个意义上讲，本文强调需要进行原位真实规模实验，并且在必要时重新定义再生水参数的适用性，并对安全使用再生水实施严格的规程，以避免对微生物群落的分布和环境中抗菌素耐药性的传播产生不良影响。

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