编译：沐秋，编辑：小菌菌、江舜尧。
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黍是许多北美草原草种的一个大属。其中包括生物燃料作物柳枝稷，以及与柳枝稷关系密切的哈氏黍，后者因其二倍体基因组和生长周期短而成为研究黍遗传学的模型系统。为了推动柳枝稷作为生物燃料作物的发展，了解寄主微生物之间的相互作用至关重要。种间相互作用可能受到植物遗传和环境因素的影响，从而产生生态型特异的表型特征。本研究比较了德克萨斯州两个种植点的两种植物基因型的根际和根内细菌群落多样性和结构差异。分析表明，采样点对根际细菌群落的变异起主要作用，但对根内细菌群落的影响较小。本研究观察到一个相对较大的核心内生微生物群，其中优势菌种主要包括根定殖细菌属链霉菌、假单胞菌和慢生根瘤菌。在两种黍类植物的基因型中，内生菌群落多样性相似，且群落结构保守。因此，对哈氏黍与其根内生菌群之间相互作用的功能性研究可以为柳枝稷作为生物燃料作物的改良进一步提供可验证的假说。
论文ID
原名：Conservation of Endophyte Bacterial Community Structure Across Two Panicum Grass Species
译名：两种禾本科植物内生菌群落结构的保护
期刊：Frontiers in microbiology
IF：4.30
发表时间：2019.10
通讯作者：Esther Singer； Thomas E. Juenger
通讯作者单位：美国能源部；德克萨斯大学奥斯汀分校
实验设计
本研究选择的柳枝稷植物包括两个生态型的克隆区系：Alamo-AP13（低地柳枝稷）和Summer-VS16（高地柳枝稷）。采用随机区组设计，在室外将克隆繁殖的柳枝稷幼苗和从种子中生长的哈氏黍幼苗种植在盆栽土壤中。在本研究中，每个位点，每个基因型设置五个重复，共40株（4个基因型×2个位点×5个生物重复=40）。
2015年8月采集了土壤、根际（RS）和根内室（RE）样品。缓慢抖动之后，附着在根1mm的土壤作为根际土壤。用45 mL Buffer洗涤根获得根际样品。根内样品收集方法如下：用35 mL自来水冲洗根，用35 mL 3%的次氯酸钠溶液消毒，同时轻轻摇动2分钟，用35mL无菌水冲洗两次，同时轻轻摇动，用液氮研磨，并在-80°C下冷冻。使用Mobio™Power土壤DNA提取试剂盒（Carlsbad，CA，USA）提取DNA。根内样品包括根内生菌和根表微生物。
为了对16S rRNA基因（V4 iTags）的V4区域进行扩增，我们使用了引物515F（5′-GTGCCAGCGCGCGCGCGCGCGCGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTTCTAAT-3′）。iTag测序按照以下程序进行：V4扩增子稀释至10nM并通过定量PCR定量，每次92个样本，并在Illumina Miseq平台进行测序。BFL位点的土壤样本在PCR扩增或测序过程中失败了两次，这可能是由于高粘土含量抑制了PCR和/或该土壤中生物量相对较低。为了一致性，以下分析中我们去除了PKL和BFL的所有土壤样本。
V4 iTag序列经质量筛选、解复用和聚类，以使用iTagger v1.2 进行操作分类单元（OTU）分析，包括质控，污染过滤，移除引物，双末端reads合并，reads聚类，OTU过滤和嵌合体移除，使用数据库进行分类等等。iTag序列使用97%的识别阈值被分为OTU簇。为了减少低丰度和假性OTUs，设置为仅当OTUs在使用QIIME v.1.9.1的至少三个样本中具有至少5个reads时，才保留该OTU。我们共在根际样品中保留了7556个OTUs，在根内样品中保留2299个OTUs。
在QIIME v.1.9.1中进行α多样性分析-观察到的OTUs、Chao1丰富度和Shannon（H′）指数。根据稀疏（表1）和非稀疏（补充表S3）OTU表的加权和未加权Unifrac距离，评估由种植地点、植物部位和植物基因型等因子解释的群落变异百分比的贡献度。基于Bray-Curtis距离进行了PCoA分析。β多样性用未加权的Unifrac计算得到，群落方差用Kruskal-Wallis检验（group_significance.py）进行因子评估，均在QIIME v.1.9.1中进行。门水平上的群落相对丰度用样本组的平均值表示。相对丰度<1%的门合并为“其他”。核心微生物组OTUs定义为存在于所有样本中的80%，并在Rarefied（图3）和非Rarefied（补充图S6）OTU表中用QIIME v.1.9.1计算比较（compute_co根内_microbiome.py）。
对来自PKL和BFL两个地点的土壤进行了分析。测定了pH值、电导率、土壤硝态氮；植物有效磷，钾、钙、镁、硫和钠、土壤有机质含量等。
结果
在本研究中，我们调查了柳枝稷及哈氏黍的地下部分细菌群落。我们分析了在德克萨斯州两个种植点种植的两种柳枝稷和两种哈氏黍生态类型的植物根际和根内的微生物群落（图1）。土壤化学研究表明，PKL和BFL土壤中N、P、C、K、Mg、S和Na浓度存在差异，其中PKL土壤之间的差异更大。导致这种变化的部分原因可能是由于PKL的土壤质地不同于BFL土壤，后者的粘土比例较高，因此压实度较高。BFL场地土壤密度高也解释了为什么该场地土壤样品的取样和测序重复失败，导致序列数量少或α多样性极低。类似地，我们发现在PKL和BFL的根际和根内样品中平均reads数更少（补充图S2）。对不同种属、不同生态型和不同种植地点的样品进行α多样性分析表明，根际微生物群落比根内群落更复杂（图2A, B），这与我们之前的结果相符。由于微生物必须克服植物免疫防御机制从而成功进入植物体内，这通常会导致微生物群落的复杂性比相应的根际和叶际中的群落复杂性要低很多。BFL和PKL两个地点的根际样品的微生物群落多样性和结构类似（图2A, B, 图3）。为了保持一致性，我们决定丢弃两个不同地点的数据，并将重点放在根际和根内中的微生物群落上。然而取样位点对根际群落的影响结果表明，植物有时间从其目的地土壤中招募和/或显现来自其来源地的遗留群落。柳枝稷栽培对土壤的影响已有报道。因此，我们的分析更多地集中在柳枝稷及哈氏黍基因型之间的总体趋势上，并不代表在本地土壤中种子发芽长成的黍草。
图1 样品来源，植物种植地点和基因型分布概况
图2 根际（A），根内（B）微生物群落的α多样性分析；（C）两个地点的根际和根内微生物群落的PCoA分析
根际和根内样本的细菌群落结果表明，根际样本按位点明显分离，而根内群落没有按位点明显分离（图2C）。根际和根内中最丰富的细菌分类群包括放线杆菌、α、β和γ-变形菌（图4）。所有样本中的细菌群落变异性受地点、植物部位和植物基因型的影响。这些因子对根际和根内中微生物群落组成和结构的贡献在定性（未加权Unifrac）和定量（加权Unifrac）上基本相等。位点解释了根际中约10-11%的群落变异性（表1C），这与之前在不同地理位置进行的研究一致。只有在考虑根际相对OTU丰度时，不同种属才会影响到β多样性（表1C，补充表S3）。根内样品不受位点或寄主种类的显著影响，但柳枝稷基因型对其细菌群落的质量影响相对较小（表1C, D）。这表明研究的黍类植物根系内的微生物群落具有较强的保守性。本研究接下来讨论了核心OTUs以及在根际和根内中对受位点、物种或基因型影响而特有的OTUs。
从80%的样品中回收到约60个根际OTUs，并在两个地点的黍类物种之间共有（补充表S5a），约占根际群落的25%。PKL和BFL-根际在所有阈值下显示出类似的共有OTUs的数量（补充表S5A）。在两个不同位点种植的柳枝稷及哈氏黍的根际核心OTU，均属于假单胞菌属、酸乳杆菌属、芽孢杆菌属和菌根缓慢菌属（图3，补充表S5B，补充图S6）。所有这些属都包含与共生功能有关的普遍存在的定殖于植物根的一些菌种。每个核心OTU的相对丰度模式在两个不同位点之间存在很大差异，表明该位点对根际群落的总体群落（图2C）和最富集的核心OTU（图3）都有显著的影响。相对丰度大于1%的几个OTUs在PKL和BFL位点之间存在显著的丰度差异（补充表S4A）。结果表明，种植地点显著影响黍类牧草对根际微生物的招募。而根内生微生物群落受不同位点的影响不大。
图3 门水平及变形菌纲上的根际和根内微生物群落的相对丰度
图4 根际和根内微生物群落的核心OTUs组成
鉴别并定量重合的核心微生物的范围及其在整个群落中的相对丰度对于评估哈氏黍作为柳枝稷微生物群研究模型的适用性非常重要，以期产生一个可以人工合成的微生物群落，并与特定的关键微生物进行机理研究。因此，我们在柳枝稷及哈氏黍的根际和根内微生物群落和物种水平上寻找共有的菌种的相对丰度及其模式，这将有助于我们在这些黍类植物之间建立类似的微生物招募假设。根际微生物群落主要由α-变形菌，γ-变形菌和放线杆菌组成，这三者约占根际菌群的50%。属于这些门/变形菌类的OTU相对丰度在两个不同位点的柳枝稷和哈氏黍中没有显著差异，他们共有的最富集的核心根际OTUs（补充表S5B）主要由酸乳杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌和未分类的α-变形菌组成（图3，补充表S5b，补充图S6）。尽管这些OTUs在两个位点都是最富集的核心OTUs，但大多数OTU在不同位点的相对丰度上存在显著差异（图3，补充表S4A，补充图S6）。一般来说，由种植地点和土壤类型驱动的群落变异性主要转化为芽孢杆菌、酸乳杆菌和未分类α-变形菌中最富集的根际核心OTUs之间的数量差异，而丰度较低的OTUs对根际细菌群落的位点特异性相对不重要。
细菌群落在BFL和PKL位点之间略有差异（表1D），但两种植物之间（表1C）或两种植物基因型之间（表1C）或不同黍类植物之间（表1D）均无显著差异。根内细菌群落的优势菌群包括放线杆菌、α-变形菌和γ-变形菌。其中慢根瘤菌、链霉菌和肠杆菌显著富集，同时它们也是根内的核心OTUs（补充表S4B, S5C）。这些根内的核心OTUs在不同地点和植物种类之间没有显著差异。比较PKL和BFL位点之间的核心OTUs结果表明，这两个位点上都存在2/3的重合核心OTUs，并且哈氏黍的核心OTUs也存在于柳枝稷的核心OTUs。相对丰度分析表明，哈氏黍根内核心菌群以慢生根瘤菌为主（19.7%），而柳枝稷核心OTUs菌群较为均匀地分布着肠杆菌、慢生根瘤菌、链霉菌和假单胞菌（图3）。在不同的地理位置和不同的黍类植物中，慢生根瘤菌的持续存在和相对丰度无关，这表明该属植物可能对柳枝稷和哈氏黍都具有重要的功能。慢生根瘤菌能通过固氮作用提高植物总氮含量。链霉菌和假单胞菌分别通过次生代谢产物的产生和固氮作用以及增溶磷酸盐来促进植物的生长。因此，我们推测这些根内核心OTUs因为参与养分获取、系统防御反应和其他胁迫应答而被招募到黍部根内。大多数根内核心OTUs也出现在根际核心OTUs中，表明植物对这些OTUs的招募在不同位点上是一致的，它们的存在并不一定与垂直遗传有关（图3，补充表S5B, C）。
我们对两个地点的柳枝稷和哈氏黍根际和根内的细菌群落分析表明，所研究的黍类植物招募了相似的根际和根内微生物。虽然总体的细菌群落结构不受寄主物种的影响，但我们观察到根际和根内的核心OTUs的优势菌种存在差异。虽然根际OTUs丰度在不同地点之间有显著差异，但这些差异是否与相关功能基因差异相匹配，从而使得植物适应不同的土壤化学和物理特征，还有待于进一步研究。根内的细菌群落及其核心菌群均未受到位点或种植物种类的显著影响。在本研究中，慢生根瘤菌存在于所有植物中。
结论
本研究首次比较了两种不同基因型的黍类植物根际和根内微生物群落的多样性和结构差异。我们的结果表明，所有研究的黍类植物根际和根内细菌群落具有显著的相似性，加上其独特的遗传特征，因此柳枝稷是一种很有前途的模式植物，可进一步用于黍类植物-土壤相互作用的研究。
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