编译：小太阳，编辑：小菌菌、江舜尧。
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目前针对三氯生肝毒性的体内暴露实验主要集中于核受体上。肝脏在代谢过程中起着至关重要的作用，且脂质代谢紊乱已经成为发病的潜在驱动因素。深入对脂质代谢变化的研究可以增进我们对三氯生的毒理学效应以及其在肝脏中潜在作用机制的理解。本研究中，我们全面评估了三氯生暴露对小鼠肝脏脂质代谢的影响。结果显示，三氯生通过增加脂肪酸的摄取和增强脂肪酸的从头合成从而诱导肝脏内游离脂肪酸池出现显著变化。此外，三氯生暴露组小鼠的肝脏中脂质水平增加，主要包括酰基肉碱、神经酰胺、三酰基甘油、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，且与三酰基甘油合成、脂肪酸氧化和炎症相关的基因也出现上调。脂质稳态的失衡能够导致膜不稳定性、脂质累积、氧化应激和炎症等。本研究阐明三氯生暴露能够诱导小鼠肝脏的脂质代谢紊乱，并进一步加剧三氯生对肝脏的损伤。
论文ID
原名：Lipid metabolism disorders contribute to hepatotoxicity of triclosan in mice
译名：脂质代谢紊乱对三氯生诱导的小鼠肝毒性具有促进作用
期刊：Journalof Hazardous Materials
IF：7.65
发表时间：2019.09
通讯作者：蔡宗苇
作者单位：香港浸会大学化学系环境与生物分析国家重点实验室
实验设计
1 实验动物与暴露实验设计
本实验选用 18 只雄性C57BL/6 小鼠，将小鼠饲养于标准的笼子里，并保证其自由饮水、进食。温度和湿度分别控制在25±2℃和 45%~65%，光照时间为 12 h。在实验开展之前，先对小鼠进行为期2 周的适应性喂养。然后将小鼠随机分为 3 组，每组 6 只，开展暴露实验。将三氯生溶于 DMSO 中，分别配制成浓度为 200 mg/mL和 2000 mg/mL 的储备液。然后用玉米油将储备液进行稀释，稀释后的终浓度为1 mg/mL和 10mg/mL。将含0.5%DMSO的玉米油作为空白对照。低剂量组和高剂量组的暴露剂量分别为10 mg/kg/d和 100 mg/kg/d。每天口服灌胃给药，每次给药时间不超过2 h，持续13 周。每天对小鼠进行称重。三氯生暴露结束后，将所有小鼠进行处死，收集肝脏组织并置于-80℃条件下保存，用于后续分析。
2 组织学分析
将冷冻的肝组织样品切成 8 μm并用苏木精和曙红进行常规染色用于组织学分析。包括肝脏中脂质的提取以及游离脂肪酸的提取。然后对肝脏蛋白进行蛋白质印记分析。
3 仪器分析
采用 Ultimate 3000 HPLC-Orbitrap Fusion Lumos MS三合一质谱系统对脂质轮廓进行分析。仪器条件参照已有的报道进行设定。进样量为10 μL。在样品序列运行之前，先运行 3 针质控样品，每运行 5 个样品运行1针质控样品。
采用UHPLC-QE-Obitrap-MS质谱系统在负离子模式下对脂肪酸进行分析。仪器条件参照已有报道进行设定。进样量为10 μL。在样品序列运行之前，先运行 3 针质控样品，每运行 5 个样品运行1针质控样品。
4 RNA 提取和qRT-PCR
取20 mg冰冻的肝脏样本，加入适量体积的 TRIzol 试剂提取总 RNA，具体操作按试剂说明书进行。用NanoDrop分光光度计检测 RNA 样本的浓度和纯度。通过qRT-PCR法检测特定基因的表达水平。使用PrimeScript RT试剂盒合成 cDNA 第一条链。逆转录总体积系为20 μL。基因的表达水平采用比较 Ct 的方法进行计算，以 GAPDH作为 qRTPCR的内参照物。
5 数据处理
使用LipidSearch软件对脂质组的原始数据进行处理以进行脂质成分的鉴定和比对。分别在正、负离子模式下提取[M−H]−、[M + HCOO]−、 [M + NH4]+、[M+H]+和 [M + Na]+离子并进行鉴定。在正离子和负离子模式下，母离子和子离子的偏差均为5.0ppm。M-socre 阈值设定为 2.0。用内标对峰面积进行归一化处理并对鉴定出的脂质进行比较分析。
用Xcalibur软件对脂肪酸的原始数据进行处理。根据[M−H]−的准确分子量对脂肪酸的色谱峰进行提取（离子偏差为5.0 ppm），主要包括月桂酸（C12：0）、肉豆蔻酸（C14：0）、棕榈酸（C16： 0）、棕榈油酸（C16：1）、十七烷酸（C17：0）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）、亚油酸（C18：2）、亚麻酸（C18：3）、花生四烯酸（C20：4）、二十碳五烯酸（C20：5）、二十二碳五烯酸（C22：5）和二十二碳六烯酸（C22：6）。用内标对峰面积进行归一化处理并进行统计分析。
6 统计分析
结果
1 三氯生暴露导致小鼠肝脏肥大
通过管饲法向不同组的雄性C57BL/6小鼠喂食浓度分别为0、10和100 mg/kg/d的三氯生。在整个暴露实验期间，三氯生对小鼠的体重影响并不显著（图 1A）。但三氯生暴露组小鼠的肝脏重量增加。如图 1B 所示，在低浓度暴露组中，肝脏重量增加 10%，而在高浓度暴露组中，肝脏重量增加 51%。此外，暴露组小鼠的脏体比也出现增加（图1C）。在高浓度暴露组，脏体比变化较为显著。就肝脏形态而言，高浓度暴露组小鼠的肝脏明显比对照组中的肝脏大（图 1D）。这与之前的发现是一致的。此外，H&E染色结果显示，高浓度暴露组小鼠肝脏出现明显的微囊泡并伴随轻度脂肪变性（图 1D）。这些结果均显示，三氯生暴露诱导小鼠出现了肝脏肥大和脂肪肝样的组织学变化。
图1 三氯生暴露对小鼠体重和肝脏的影响。（A）整个暴露期间的体重。（B）肝脏重量。（C）三氯生暴露 13 周的小鼠的肝脏器官系数
2 三氯生暴露导致小鼠肝脏脂质轮廓发生变化
基于液相色谱质谱联用技术对小鼠肝脏样本进行了脂质轮廓分析。偏最小二乘判别分析结果显示，在正、负离子模式下，对照组和三氯生暴露组均能明显分开（图 2A 和2B），这表明三氯生暴露导致小鼠肝脏的脂质代谢表型发生改变。数据采集过程中共检测到 908 种脂质，在这些脂质中，通过LipidSearch软件，可以准确的鉴定出涵盖18个亚类，共计562种脂质。其中有一半的脂质属于甘油磷脂（GP），包括 141 种磷脂酰胆碱（PCs）、22 种溶血磷脂酰胆碱（LPCs）、15 种甲基磷脂酰胆碱（MePCs）、83种磷脂酰乙醇胺（PEs）、9 种溶血磷脂酰乙醇胺（LPEs）、1 种二甲基磷脂酰乙醇胺（dMePE）、14 种磷脂酰甘油（PGs）、15 种磷脂酰肌醇（PIs）、2 种溶血磷脂酰肌醇（LPIs）和 5 种磷脂酰丝氨酸（PSs）。在总脂质中，大约有三分之一的脂质属于甘油酯类，主要包括 132 种甘油三酯（TGs）、37 种甘油二酯（DGs）。鞘脂种类占总脂质的 10%，主要包括 224 种神经酰胺（Cers）、7 种葡糖苷酰鞘氨醇（CerGs）、40 种鞘磷脂（SMs）和 1 种鞘氨醇。此外，还鉴定出 6 种酰基肉碱（AcCas）、7 种胆固醇酯（ChEs）和 1 种（o-酰基）-1-羟基脂肪酸（OAHFA）。取p<0.05和 FC>1.5作为筛选标准，发现低剂量暴露组中有48 种脂质发生显著变化，且高剂量暴露组中有 188 种脂质发生显著变化，这说明三氯生暴露会影响肝脏中的脂质组成且存在明显的剂量依赖效应，高剂量的三氯生暴露导致细胞间的脂质出现更为明显的扰动。为进一步探究脂质池的变化，我们对每一类脂质的总相对丰度进行了计算。如图 2C~F所示，低剂量暴露组中，LPC、PE、LPI和Cer均出现显著增加。而在高剂量暴露组中，PC、PE、PI、LPC、LPI、dMePE、AcCa、Cer 和TG显著增加，ChE和CerG显著降低（p<0.05）。这些数据可以说明三氯生暴露可能会影响到涉及脂质生成和代谢的多条代谢通路。为了揭示三氯生暴露对脂代谢的影响，我们主要针对高剂量暴露组进行了深入研究。
3 三氯生暴露诱发甘油磷脂再修饰过程
对两类主要的 GP （包括 PC 和 PE）的脂肪酰基组成进行了分析。如图 3A 所示，高剂量暴露组中含醚键、饱和脂肪酸链和多不饱和脂肪酸的 PCs 出现显著升高，但在低剂量暴露组中并未出现显著变化。此外，三氯生暴露并未影响含单不饱和脂肪酸的PCs 的丰度。对于 PEs 来说，在三氯生暴露组中，含醚键和单不饱和脂肪酸链的组分均出现显著升高。高剂量暴露组中含饱和脂肪酸链的 PEs 出现显著升高，而含多不饱和脂肪酸链的 PEs 则无显著变化（图 3B）。这些结果均表明，三氯生暴露导致肝细胞内发生了 GP 的再修饰过程。
图 3 含不同脂肪酰基成分的 PCs 和 PEs 的丰度变化。
4 三氯生暴露导致 TG积累及其脂肪酰基链组成的变化
在高剂量暴露组中发现总 TG 的丰度出现显著升高，表明肝脏中出现脂质积累的趋势（图 2D）。通过分析脂肪酰基的组成发现，高剂量暴露组中含C16:1、C17:1、C18:1、C18:2、C18:3、C20:5和C22:5的 TGs 水平更高。而在低剂量暴露组中则无明显变化（图 4A）。DGs 中的脂肪酰基链基本无变化，只有高剂量暴露组中的C18:3出现升高（图 4B）。这些数据表明高剂量三氯生暴露导致小鼠肝脏内的TG 合成通路出现扰动。
图 4 含不同脂肪酰基成分的 TGs（A）和 DGs（B）的丰度变化。
5 三氯生暴露导致小鼠肝脏中游离脂肪酸池出现变化
作为脂质合成的重要来源，本研究通过 LC-MS技术对游离脂肪酸水平进行了分析。如图 5 所示，三氯生暴露组中大多数游离脂肪酸的水平出现显著升高（p<0.05）。C12:0、C16:0、C17:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:4、C20:5和C22:6水平在高、低剂量暴露组中均出现显著升高，而C14:0、C16:1和C18:0水平仅在高剂量暴露组中显著升高。这些游离脂肪酸的总丰度在暴露组中也出现显著升高，这表明三氯生暴露诱导小鼠肝脏中的游离脂肪酸池发生变化。
图5 三氯生暴露诱导的小鼠肝脏中 FFA 水平的变化。
6 三氯生暴露导致与脂肪酸代谢及炎症相关的基因表达出现变化
为了深入了解FFAs 和 TGs 积累的潜在机制，我们对相关基因的表达进行了评估。结果显示，三氯生暴露导致与脂肪酸摄取相关的基因表达显著升高，包括脂肪酸转位酶（Fat）、脂肪酸转运蛋白 2 和 5（Fatp2 和Fatp5)和血浆膜性脂肪酸结合蛋白（Fabppm）（图 6A）。在三氯生暴露组中，硬脂酰辅酶 A去饱和酶-1（Scd）和转录因子固醇调节元件结合蛋白-1c（Srebp-1c）的表达显著升高，而乙酰辅酶 A 羧化酶α（Acc1）的表达显著降低，脂肪酸合酶则无显著变化（图 6 B）。在高剂量暴露组中，与 TG 合成相关的基因出现显著上调，主要包括乙酰辅酶 A 合成酶（Acsl）、磷脂酸磷酸水解酶（Lpin1）、甘油二酯O-乙酰-转移酶1 和 2（Dgat1和Dgat2）（图 6 C）。蛋白质印迹分析结果进一步显示，三氯生暴露显著升高了CD36、SREBP-1C和ACSL蛋白的水平（图 6 S）。因此，这些结果表明，三氯生暴露通过上调脂肪酸摄取和生物合成来提高脂肪酸的利用率，并通过增加TG的生物合成来增加肝脏中FFA和TG的含量。
有趣的是，随着AcCa含量的升高，肉碱棕榈酰转移酶1（Cpt1）和细胞色素P450 4A10（Cyp4a10）的上调以及CPT1蛋白含量的升高等一系列变化的出现，这均变表明三氯生暴露增加了小鼠肝脏内的脂肪酸氧化。尽管在高剂量暴露组中转录因子过氧化物酶体增殖物激活的受体α（PPARα）的mRNA水平升高，但PPARα蛋白水平未见明显变化（图6D和 F）。此外，暴露组的小鼠体内炎性细胞因子（TNF-α，IL-1β和IL-6）的mRNA的表达升高（图6E）。
图6 与肝脏脂代谢相关的基因的表达。设计不同途径的 RT-qPCR 分析结果（A）脂肪酸摄取（B）脂肪酸的从头合成（C）TG 合成（D）脂肪酸氧化（E）炎症。
讨论
将三氯生作为作杀菌剂已有将近有40年的历史了。近期对于三氯生的研究已经引起了人们对其安全性的广泛关注。研究者已开展了多项体内实验来评估三氯生对实验小鼠和大鼠肝脏功能的影响，结果显示三氯生能够诱导核受体CAR和PPARα的活化并促进肝肿瘤的发生。在本研究中，我们进一步分析了三氯生对小鼠下游代谢表型的影响。据报道，PPARα在许多通路中都有涉及，包括脂肪酸结合和转运、脂肪酸活化、过氧化物酶体和线粒体内的脂肪酸氧化、脂肪形成、肝癌发生等。此外，研究发现三氯生会干扰水生生物和鸟类的脂质代谢。因此，本研究分析了三氯生对小鼠肝脏脂质代谢的影响。在三氯生暴露组的小鼠肝脏中观察到GP再修饰、FFA、TG和Cer的积累以及脂肪酸氧化和炎症的加剧等。ROS的产生和炎症的加剧已被视为肝损伤最常见的机制。已有报道显示，在经三氯生暴露的小鼠体内可以观察到这些变化，而这些变化的出现则可以导致肝纤维化。本研究中，三氯生诱导的脂质代谢紊乱也可能加重这些不良反应，从而进一步加剧三氯生诱发的肝毒性。
本研究中，我们设置低剂量（10 mg/kg/d）和高剂量（100 mg/kg/d）的三氯生对小鼠进行13周的暴露。已有研究发现三氯生暴露（68.6 mg / kg/d，8 个月）会增加雄性C57BL / 6小鼠的肝细胞增殖和肝纤维化。而在经75 mg / kg / d三氯生暴露13周的CD-1小鼠中体内，丙氨酸转氨酶（ALT）水平升高。此外，经125 mg / kg / d 三氯生连续暴露13周后，小鼠的肝脏重量、ALT和碱性磷酸酶的水平以及肝细胞肥大的发生率均显著增加，这些变化与PPARα的激活有关。本研究中，三氯生暴露导致小鼠肝脏重量显著增加且引发明显的组织学改变，这与之前的研究结果一致。
众所周知，脂质是具有许多重要细胞功能的基础代谢产物，而且肝细胞在脂质代谢中也起核心作用。肝脏脂质稳态的变化可能会导致肝脂肪变性，继而发展为脂肪性肝炎、纤维化和肝硬化。近年来，基于质谱技术的脂质组学在脂质功能障碍的研究中越来越普遍。该方法的普及有助于我们理解与疾病发病机制相关的代谢表型变化。GP是细胞膜中的主要脂质。在本研究中，PC、PE、PI、LPC和LPI的总丰度出现增加，这可以表明三氯生暴露对膜功能产生了影响（图2A）。此外，有研究发现，与人类和啮齿类动物的正常肝脏相比，出现脂肪变性的肝脏中PC和LPC水平升高。另有研究发现LPC的水平与氧化应激和炎症密切相关，而且LPC在FFA致肝细胞脂质凋亡中起重要作用。综合以上研究结果，三氯生暴露导致小鼠体内LPC和PC的水平升高，这表明肝细胞中可能出现了脂毒性。PC和PE是生物膜中的主要骨架成分。PC和PE含量的增加可能是由于在细胞增殖过程中补充膜成分引起的。此外，含单不饱和脂肪酸链的PE和含多不饱和脂肪酸的PC含量的增加表明脂肪酰基链的饱和度发生了变化。GPs的饱和度与膜的流动性有关。而且，多不饱和脂肪酸更容易发生过氧化，从而导致细胞损伤。在三氯生暴露组中还观察到通过醚键连接的PC和PE的含量增加。已有研究表明，醚脂不仅能够促进膜融合过程，而且还会影响生物膜的稳定性。此外，烯醇醚双键更容易受到多种活性氧（ROS）的影响。已有大量的研究证实三氯生具有促氧化作用，醚键连接的PC和PE含量的升高可能会使生物膜更易受到氧化应激的影响。因此，三氯生暴露诱导的GP再修饰可能与小鼠肝脏中的膜不稳定性及对ROS的敏感性有关。
作为脂质合成的重要来源，三氯生暴露组中FFA含量显著增加。最新研究数据表明，肝细胞中FFA的积累会诱发脂毒性。在本研究中，我们发现FFA含量升高是由于脂肪酸摄取和生物合成上调导致的。肝脏中C18：2和C18：3的积累也证明了脂肪酸摄取出现上调，因为细胞中不能合成C18：2和C18：3，所有需要从饮食中获取。FFA水平的升高会促进糖尿病和肥胖症中ROS的产生，从而加剧线粒体功能障碍。我们推测，三氯生暴露的小鼠体内FFA的增加可能会促进ROS的产生并增加出现脂毒性的风险。据报道，三氯生能够激活PPARα而不影响其水平，但会增加PPARα靶向基因（如Cyp4a10，Cpt1等）的表达。我们的研究结果与这些发现相一致。Cyp4a10在线粒体脂肪酸β氧化中起作用。此过程涉及NADPH依赖的电子传输通路，并可能导致H2O2的生成，而众所周知，H2O2是一种具有破坏性氧化剂。加之AcCa水平的升高，这均表明，三氯生暴露导致小鼠体内脂肪酸氧化增强并增加产生ROS的风险。
我们还发现，在高剂量暴露组中，总 TG 丰度出现显著升高，这表明肝脏中出现了脂质积累的趋势。我们推测，TG 的积累可能是由于FFAs利用度的增加以及参与TG 生物合成的基因上调所致。之前针对水生动物和禽类肝脏以及哺乳动物肝细胞的研究已经表明，三氯生暴露能够诱导哺乳动物肝脏中出现脂质积累。人们通常认为肝脏中 TG 的积累会导致脂肪肝。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的主要特征是肝脏中出现TG的大量积累，TG 的积累可能会引发更严重的非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并伴有肝细胞损伤和炎症，甚至出现纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞性肝癌。据报道，三氯生可诱发小鼠肝脏内发生肝纤维化并促进肝肿瘤的发展。我们认为TG的积累可能会加剧此过程。
本研究中，我们还观察到在三氯生暴露的小鼠体内Cer的水平显著升高，且炎症因子(TNF-α、IL-1β 和 IL-6)的mRNA 出现在更高程度的表达（图 2E 和 6E）。作为鞘脂家族的成员，Cer不仅是细胞膜的重要组成部分，而且还具有细胞信号传导特性。已经证明Cer与肝病中涉及的氧化应激、炎症和细胞凋亡等通路有关。炎症因子和 ROS 的诱发过程能够激活Cer的合成。Cer还能够通过激活B细胞核因子κ轻链增强子（NF-κB）来调节促炎基因的表达，从而促进持续性炎症的反馈性放大机制。肝炎是肝病的常见诱因，通常被认为是肝组织损伤的主要驱动力，加剧了从NAFLD到严重纤维化的发展过程，并最终导致肝细胞性肝癌。因此，我们推测三氯生诱导的肝毒性可能在一定程度上是由与炎症相关的Cer代谢途径的变化引起的。
结论
综上所述，本研究阐述了三氯生对肝脏脂质稳态的影响。三氯生暴露会导致 GPs 再修饰、Cer含量增加、FFAs和 TG积累、脂肪酸氧化增加及小鼠肝脏中脂肪酸成分的相关变化（图 7）。这些过程可能进而引发膜功能障碍、氧化应激和炎症，而这些过程在肝损伤中起重要作用。我们的研究还证明了三氯生在脂质代谢方面的肝毒性，进一步加深了我们对三氯生毒性效应的了解。接下来的研究应覆盖与人类相关的样本，这样才能更好的评估三氯生对人类肝脏代谢过程的影响。
图7 三氯生影响肝脂质和相关基因表达模式的机制示意图。
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