编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肠道菌群的改变会影响包括癌症在内的多种疾病的病理生理学。放射治疗(Radiotherapy,RT)是一种公认的治疗性和姑息性癌症治疗方法，具有强大的免疫调节作用，可诱导肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen, TAA)与抗肿瘤的CD8+ T细胞相互诱导和作用。在本研究中，研究者试图探究肠道微生物群是否可以调节远端RT后的抗肿瘤免疫应答。万古霉素(Vancomycin)是一种主要作用于革兰氏阳性菌并局限于肠道的抗生素，可增强RT诱导的抗肿瘤免疫反应从而抑制肿瘤生长。上述协同作用依赖于TAA与细胞毒性CD8+ T细胞的交叉提呈和IFN-γ的分泌。值得注意的是，由肠道细菌产生的代谢物丁酸盐可以很大程度上消除万古霉素的作用。总之，去除万古霉素敏感菌可增强RT的抗肿瘤活性，这一发现对于放射治疗具有重要的临床指导意义。
论文ID
原名：Gut microbiota modulate dendritic cell antigen presentation and radiotherapy-induced antitumor immune response
译名：肠道微生物群调节树突状细胞抗原表达和放疗诱导的抗肿瘤免疫应答
期刊：J Clin Invest.
IF：12.282
发表时间：2019年12月13日
通讯作者：Andrea Facciabene，Constantinos Koumenis
作者单位：宾夕法尼亚大学医学院放射肿瘤学系
实验内容
1 口服万古霉素可增强低分次照射的直接和非局部抗肿瘤效果
在B16-OVA(图1A)和TC-1(图1C)小鼠皮下肿瘤模型中观察到，万古霉素与RT联合治疗产生的抗肿瘤作用大于万古霉素单独或单独RT介导的抗肿瘤作用(RT+万古霉素组分别与未治疗组、万古霉素组和RT组比较，P<0.001)。相反，预先给予革兰氏阴性靶向抗生素(即Neo/Met)则并不能增强RT的抗肿瘤效果。此外，与对照组、未治疗组和单独接受RT治疗的队列相比，RT+万古霉素联合治疗的B16-OVA(图1B)和TC-1(图1D)小鼠的非放射(远端)肿瘤生长在也显著降低。值得注意的是，当21-Gy剂量的RT被直接注射到B16-OVA肿瘤中时，无论是否使用万古霉素，RT都可以控制原发肿瘤的生长(图1E)，这与我们之前的结果是一致的。然而，在远端肿瘤中，与单纯放疗相比，加入万古霉素的肿瘤生长明显减少(P<0.01)(图1F)。总而言之，这些结果表明，万古霉素通过非局部效应在肿瘤局部和全身增强了RT介导的抗肿瘤效应。
图1黑色素瘤和肺/颈部肿瘤模型中，口服万古霉素可增强低分次照射的直接和非局部抗肿瘤效果. B16-OVA黑色素瘤模型(A)或TC-1肺癌/宫颈癌模型(C)和远端肿瘤(分别为B和D)中：照射肿瘤的对照(未治疗)、万古霉素单独治疗(Vanco)、单独放疗(RT)或万古霉素加RT联合治疗(RT+Vanco)的肿瘤体积。(E)单纯放疗或放疗加万古霉素(F)治疗的小鼠的B16-OVA肿瘤体积，来自单独放疗或放疗加万古霉素的小鼠的B16-OVA肿瘤体积，n=5~14只/组。
2 万古霉素的放疗增敏作用在CD8耗竭的小鼠中被抵消
在单用万古霉素、单用RT和RT+万古霉素联合治疗的B16-OVA原发肿瘤中，均可检测到CD3+T细胞浸润(分别为P<0.001和P<0.05)(图2A)。单纯放疗或放疗+万古霉素联合治疗的B16-OVA异位肿瘤也有CD3+T细胞浸润，且放疗+万古霉素联合治疗组CD3+T细胞浸润明显高于单纯放疗(P<0.05)(图2A)。将万古霉素单独、RT或RT+万古霉素联合治疗的小鼠肿瘤消化，用流式细胞仪检测单个细胞四聚体染色。结果显示，RT+万古霉素联合治疗的小鼠肿瘤中卵清蛋白特异的CD8+T细胞(即CD45+/CD3+/CD8+/TET-OVA细胞的百分比)明显高于对照组、万古霉素单独治疗的肿瘤和单纯放疗的肿瘤(图2B)，表明联合应用RT+万古霉素的小鼠肿瘤中OVA特异性T细胞的数量(即CD45+/CD3+/CD8+/TET-OVA细胞的百分比)明显高于对照组、万古霉素单独治疗的肿瘤和单纯放疗的肿瘤。为了确定在接受RT+万古霉素联合治疗的小鼠中CD8+T细胞浸润的增加与改善的抗肿瘤反应之间是否存在因果联系，研究者通过用CD8单克隆抗体预处理小鼠来选择性地耗尽CD8+T细胞。在RT+万古霉素联合治疗之前，CD8+细胞的耗尽消除了联合治疗的抗肿瘤作用(图2C)，表明CD8+T细胞是介导观察到的抗肿瘤作用所必需的。综上所述，这些实验结果表明，万古霉素通过抗肿瘤特异性CD8+T细胞的机制来增强RT介导的全身性抗肿瘤效应。
图2 在CD8耗竭的小鼠中，万古霉素的放疗增敏作用被抵消. (A)用免疫组织化学方法对未治疗、万古霉素单独治疗(Vanco)、单纯RT治疗(RT)或万古霉素+RT联合治疗(RT+Vanco)的B16-OVA来源的原发肿瘤组织切片和RT+ Vanco联合治疗的异位肿瘤组织切片进行CD3+细胞浸润的定量。 (B)消化各治疗组的原发肿瘤组织，流式细胞仪分析单个细胞，测定OVA特异性CD8+T细胞(CD45+/CD3+/CD8+/Tet-OVA)的百分率(CD45+/CD3+/CD8+/Tet-OVA)。(C) CD8耗竭小鼠的肿瘤生长曲线。
3 万古霉素联合RT的抗肿瘤作用依赖于干扰素-γ
为了确定IFY-γ是否参与放疗+万古霉素联合治疗在肿瘤微环境中的抗肿瘤作用，研究者在照射后5天检测了IFY-γ在B16-OVA肿瘤中的表达。结果发现RT+万古霉素联合治疗组的IFY-γ mRNA表达水平明显高于单独应用万古霉素或单纯RT治疗组(图3A)。在此之前，我们曾报道万古霉素联合T细胞治疗可诱导CD8+ DC扩增，并影响IL-12水平；反过来，IL-12刺激IFY-γ的产生，促进Th1分化和CTL活性。同时，我们发现RT+万古霉素联合治疗组IFY-γ蛋白表达水平显著升高 (图3B)。放疗+万古霉素联合治疗的肿瘤患者的IFY-γ +CD8+T细胞数量明显高于单独治疗的肿瘤患者(两组比较均P<0.0 5)(图3C)。此外，在B16-OVA IFY-γ基因敲除小鼠中，万古霉素对辐射效应的增强作用被消融(与RT和万古霉素相比，分别为P=0.5601和P=0.0911)(图3D)。这些结果表明，万古霉素能改善肿瘤微环境，增强肿瘤特异性CD8+T细胞的功能，IFY-γ是增强RT诱导的抗肿瘤免疫效应所必需的。
图3 万古霉素联合RT的抗肿瘤作用依赖于干扰素-γ. (A)照射后5天(21Gy)收集的B16-OVA原发肿瘤组织中IFN-γ的 mRNA表达水平。(B)放射治疗后5天(21Gy)肿瘤裂解液中IFN-γ蛋白表达水平的酶联免疫吸附试验(ELISA)分析。(C) KB-OVA多肽刺激后浸润的T细胞内IFN-γ的表达。(D)万古霉素+RT联合治疗在IFN-γ-KO小鼠体内的抗肿瘤作用消失。
4 万古霉素治疗可增加肿瘤局部TAA交叉呈递和抗原识别
研究表明，适当的剂量和时间安排的大剂量放疗可以导致增加T细胞启动和T细胞依赖性肿瘤消退。因此，研究者推测抗原提呈增强可能是CD8+T细胞活性增强的驱动因素。因此检测了Ifnb1在肿瘤引流淋巴结(TDLNs)和B16-OVA肿瘤放疗后的表达水平。与单纯RT相比，万古霉素治疗在TDLN (图4A)和肿瘤中协同增强了Ifnb1基因的表达。接下来，研究者用针对MHC1(KB)-SL8 OVA肽的抗体对TDLN细胞悬液进行染色，直接评估了MHC-I类抗原提呈水平，发现RT+万古霉素联合治疗组的DC与RT相比显著增加(P=0.0396)(图4B和补充图9)。为了证实治疗动物TDLN中功能性抗原提呈的增加，通过将OT1 T细胞与来自治疗小鼠的APC共培养来评估IFY-γ的产生。考虑到在体内，反应性T细胞的启动主要发生在淋巴结，为了保持体外淋巴组织的复杂性，我们使用了完整的TDLN细胞悬液作为APC的来源。具体地说，我们培养了来自B16-OVA肿瘤的TDLN的细胞悬浮液，该肿瘤来自RT+万古霉素联合治疗或单独RT治疗的小鼠，在OVA肽与OT1T细胞一起缺失或存在的条件下进行IFY-γ ELISPOT试验(图4C)。为了证实ELISPOT中所有的IFY-γ信号都是由OT1 T细胞产生的，我们还单独接种了TDLN，没有检测到任何明显的斑点。然而，当与OT1T细胞共培养时，我们观察到RT+万古霉素联合治疗的小鼠的TDL与单独RT的TDL相比，产生IFY-γ的细胞数量显著增加(分别为P=0.0398和P=0.0010，在没有或存在OVA肽的情况下)(图4C)。
接下来，为了证实CD11c+DC对初始OVA特异性T细胞的启动作用，我们从TDLN中纯化了CD11c+群体，并建立了IFY-γ ELISPOT方法，将来自各治疗组的TDLN中的CD11c+DC与Naive OT1 CD3+T细胞进行共培养。我们的结果表明，万古霉素联合RT可增强CD11c+DC的局部抗原提呈功能(图4D)。此外，通过细胞内染色，我们证明了从RT+万古霉素组分离的CD11c+细胞特异性地增加了未诱导的OT1细胞产生IFY-γ的CD8+T细胞(即产生IFY-γ的CD8+T细胞的百分比)(P<0.0 5)(图4E)。最后，我们分离了B16-OVA治疗小鼠肿瘤，并将其与OT1 OVA特异性CD8+T细胞共孵育，ELISPOT检测产生IFY-γ的细胞。与单纯放疗相比，RT+万古霉素联合治疗可促进IFY-γ的分泌(P=0.0016)(图4F)。重要的是，MHC1阻断抗体显著减少了IFY-γ的产生细胞，证明了MHC1依赖于CD8+T细胞的激活(P=0.0073)(图4F)。在TC-1肿瘤模型中也观察到了类似的结果。总而言之，上述数据表明万古霉素增强了局部抗原提呈，促进了抗原特异性T细胞对肿瘤的识别。
图4 万古霉素治疗可增加肿瘤局部TAA交叉呈递和抗原识别. (A)照射后1天，TDLN中IfNb1 mRNA的表达水平。(B)放疗后5天，肿瘤浸润的CD11c+CD103+ DC进行抗MHC1(KB)-SL8OVA多肽染色。(C) IFN-γ ELISPOT法，用TDLN单细胞悬液和OT1T细胞(1：5=TDLN细胞/T细胞)在无(左)或有(右) OVA的情况下培养。RT处理5天后收集细胞。(D)将各处理组纯化的CD11c+DC与未成熟的OT1 T细胞共培养过夜，用IFN-γ ELISPOT法(1：10=DC/T细胞)孵育。(E)与每种治疗方法处理的小鼠树突状细胞共培养过夜的OT1细胞表达IFN-γ的百分比。(F)小鼠B16-OVA型肿瘤经RT单独或RT+万古霉素(RT+Vanco)联合处理后，与OT1细胞在IFN-γ ELISPOT平板上共培养24h，n=5~10只/组。
5 短链脂肪酸在体外可降低APC活性，在体内可阻断万古霉素增强的RT抗肿瘤活性
鉴于DC在T细胞启动中的中心作用和CD8+T细胞在RT+万古霉素联合应用中的作用，研究者在体外研究了C3 (醋酸盐)和C4(丁酸盐)在DC APC功能中的潜在作用。为此，通过骨髓细胞在GM-CSF/IL-4中培养7天并加入C3和/或C4来生成骨髓DC (BMDC)。用全长OVA冲击的DC与取自OT 1小鼠的T细胞进行IFN-γ ELISPOT实验。结果表明，C4单独抑制DC的抗原前体细胞功能，与未处理的对照组相比，C4处理的BMDC分泌IFN-γ的细胞减少。有趣的是，C3处理的DC单独使用时也表现出对抗原提呈的部分抑制，但不能加强C4单独诱导的抑制 (图5A)。为了确保SCFA主要影响DC而不是T细胞，我们评估了C4对纯化的T细胞的直接影响，方法是在C4存在或不存在的情况下，用a CD3/a CD28抗体刺激从健康小鼠脾细胞中纯化的过夜T细胞。在a CD3/a CD28刺激过程中，C4的存在对T细胞产生IFN-γ没有明显影响(图5B)。与先前发表的结果一致，这些数据证实了单链脂肪酸对DC表型和抗原提呈抑制的影响。然后在小鼠饮水中加入丁酸盐，观察C4/丁酸盐在体内是否会对RT+万古霉素联合治疗的协同效应产生负面影响。1天后，用B16-OVA接种小鼠，当肿瘤体积达到大约50mm3时进行照射(21Gy)。与我们以前的结果一致的是，万古霉素增强了RT的抑瘤作用，但C4的加入消除了这一作用(图5C)。我们计数了小鼠淋巴结中呈现OVA的树突状细胞，发现用丁酸盐治疗的小鼠这一数量显着减少(图5D)。采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测肿瘤组织中IFNG和IL12bmRNA的表达水平。值得注意的是，当C4纳入治疗方案时，万古霉素对IFN-γ和IL12b水平的影响降低(图5E)。最后，与RT+万古霉素相比，在RT+万古霉素治疗中加入丁酸盐降低了肿瘤内抗原特异性T细胞的百分比(图5F)。综上所述，该结果表明，肠道细菌产生的C4/丁酸在体外削弱了APC的活性，干扰了交叉启动活性，并在体内抵消了万古霉素增强的RT介导的抗肿瘤作用。
图5 短链脂肪酸在体外可降低APC活性，在体内可阻断万古霉素增强的RT抗肿瘤活性. (A)骨髓来源的树突状细胞(BMDC)未处理，用100 mM丁酸盐(C4)处理，或用100 mM丙酸(C3)和OVA (100 mg/mL)处理24h，然后与OT1小鼠的T细胞一起接种于ELISPOT板上。(B)纯化的T细胞在IFN-γELISPOT平板中，在有或无100 mM C4/丁酸盐的情况下，用aCD3/aCD28刺激纯化的T细胞。(C)用含万古霉素的饮用水加或不加C4对照射小鼠肿瘤生长的体内影响。(D)用含万古霉素的饮用水加和不加C4/丁酸盐的照射小鼠肿瘤中IFN-γ mRNA的表达水平。(E)流式细胞术分析OVA呈递的DC和(F)CD3+CD8+Tet-OVA+细胞亚群。
6 万古霉素处理改变了短链脂肪酸浓度和肠道细菌群落组成
为了确定丁酸盐生产和万古霉素处理之间是否存在因果关系，研究者检测了万古霉素处理是否降低了小鼠粪便中SCFAs的水平，并改变了肠道微生物群中产生SCFAs的细菌的比例。收集未给药组、单用万古霉素组和RT+万古霉素联合用药组小鼠的盲肠内容物和粪便，分析其补体C4水平。与未治疗的对照组相比，单用万古霉素或RT+万古霉素联合治疗显著降低了C4浓度(图6 A和B)。由于血液和组织中的SCFA浓度已被报道明显低于肠道内容物中的浓度，通过收集未治疗(对照)或经万古霉素治疗的荷瘤动物的组织，研究了万古霉素在TDLN和肿瘤中的作用。我们观察到，在肿瘤和TDLN组织中，万古霉素显著减少了C4的含量(图6 C和D)。据报道，相对于粪便，盲肠中的细菌Firmicuts门在产生短链脂肪酸中更为丰富。因此，通过16S rRNA测序，证实单用万古霉素处理后，革兰氏阳性单链脂肪酸产生菌的水平显著降低。对口服0.5g/L万古霉素的小鼠的粪便样本进行测序，并与未处理的对照组小鼠的粪便样本进行比较。正如预期的那样，发现万古霉素处理引起了细菌群落组成的巨大变化，包括消除了大多数革兰氏阳性菌群，并对革兰氏阴性菌产生了一些影响(图6E)。结果表明，在万古霉素治疗组中发现的细菌数量比未治疗对照组降低了4倍 (图6F)。通过unweighted UniFrac distance的算法分析表明，万古霉素处理后细菌群落的组成发生了较为一致的变化，对照组和万古霉素治疗组内样本距离显著低于组间距离(图6G)。万古霉素治疗消除了产生短链脂肪酸的Clostridia中的2个主要科： Ruminococcaceae 和Lachnospiraceae (两个科均P<0.01)(图6H)。接下来，将分配给Clostridiales的16S序列与所有特征细菌物种的数据库进行了比对，并使用90%的序列相似性截断来检查归属于最匹配的细菌物种的SCFA产物。基于上述的分析，可以确定万古霉素治疗组没有显示出Clostridiales中剩余的丁酸产生菌的丰度。上述数据表明，万古霉素治疗靶向针对革兰氏阳性细菌群体，包括丁酸产生菌，并降低粪便和组织样本中的SCFA浓度。
图6 万古霉素处理改变了短链脂肪酸浓度和肠道细菌群落组成. (A)粪便中C4单链脂肪酸浓度，(B)盲肠内容物，(C)肿瘤，(D)TDLNs。(E)万古霉素处理小鼠的细菌分类丰度热图。白色方块表示样本中没有观察到的分类群；每组n=3个。(F)16S rRNA标记基因测序测定细菌群落多样性。(G)对照组和万古霉素暴露组小鼠粪便中细菌群落的差异。(H)已知含有产生丁酸的细菌种类的相对丰度。
结论
评论
放射治疗是目前一种公认的抗肿瘤治疗方法，大约有超过50%的新诊断的实体瘤患者在治疗过程中的某个时间点需要接受放射治疗，并且通常与化疗相结合。其中，高剂量、低分割放射治疗最初作为立体定向放射外科引入颅内肿瘤，后来扩展到颅外部位作为立体定向放疗(stereotactic body RT, SBRT)(8-30Gy/次)。低分割、高剂量RT可引起肿瘤细胞免疫原性死亡(immunogenic cell death, ICD)，并通过肿瘤相关抗原交叉免疫诱导适应性抗肿瘤免疫。放射治疗与免疫治疗的结合是目前人们关注的热点，因其可将放射治疗从用于治疗局部疾病的方式转变为用于治疗全身恶性肿瘤的方式。然而，有关剂量、时机、患者选择和毒性的几个问题仍然需要解决。此外，免疫疗法与其他方法的结合只在一小部分患者中治愈，这提出了一个问题，即是否还没有发现放疗介导的抗肿瘤免疫反应的重要调节因素。
肠道微生物群在二级和三级淋巴结构中起着关键作用：缺乏微生物群的无菌小鼠有较小的Peyers结，因此CD4+T细胞和产生IgA的浆细胞的数量也减少。事实上，早期的研究已经发现，在无菌条件下饲养的小鼠对病原体的宿主免疫反应明显受损。此外，肠道微生物群中特定细菌的存在与T细胞的发育和分化存在直接关系。由于肠道微生物群影响T细胞和其他免疫细胞亚群的功能，包括肠道相关淋巴组织(GALT)内和肠道相关淋巴组织之外的T细胞和其他免疫细胞亚群的功能，微生物群衍生的信号已被证明在调节多种疾病及其治疗中具有广泛的作用，包括癌症及其对化疗的反应。因此，研究者假设肠道微生物群的扰动可以调节消融性放疗的抗肿瘤效应，并影响抗原特异性的抗肿瘤反应。
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