编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
肠道炎性疾病引起许多与健康有关的问题，并降低了发展中国家和工业化国家的生活质量。表观遗传机制最近被认为是在微生物群和肠上皮细胞（IEC）基因组之间的界面起作用，并且是炎症性肠病（IBD）发病机理中的关键角色。DNA甲基化是一种化学标记系统，用于通过影响蛋白质结合和染色质结构的能力引起基因表达变化来注释遗传信息。肠道菌群通过修饰整个肠道中的宿主基因表达来调节肠道生理，但其潜在机制仍未阐明。为阐明肠道微生物组如何影响正常和治病条件下肠道稳态，本研究在常规饲养和无菌的小鼠上进行全基因组亚硫酸氢盐测序，诱导小鼠体内损伤，评估体重、粪便粘稠度和粪便含血量以及肠溃疡、隐窝结构丧失和结肠缩短。诱发GF小鼠的炎症反应，并以成年的GF小鼠作为粪便移植受体饲养在无菌隔离器中，11周处死。之前，取出组织进行组织化学、免疫组织化学和组织学评分，最后进行测序，并对相应的结果进行转绿组测序和甲基化数据集合，最后进行q-PCR分析验证，利用ATAC分析开放染色质。
结果显示暴露于共生菌群会导致调节元件上的局部DNA甲基化变化，这是TET2/ 3依赖性的，而且最终激活了一组“早期哨兵”反应基因，以维持肠道的动态平衡。此外，本研究还证明了暴露于右旋糖酐硫酸钠引起的急性炎症中的微生物会导致DNA甲基化和染色质在调节元件上的可及性发生变化，从而导致基因表达程序发生改变，这些基因表达程序富含结肠炎和结肠癌相关功能。最后，结果表明微生物群诱导的表观遗传程序对于体内适当的肠道稳态是必要的。
论文ID
原名：The microbiota programs DNA methylation to control intestinal homeostasis and inflammation
译名：微生物群通过DNA甲基化来控制肠道内平衡和炎症
期刊：Nature microbiology
IF：11.878
发表时间：2020.02
通讯作者：Thomas Scheuerl
作者单位：伦敦大学
实验设计
本研究在常规饲养和无菌的小鼠上进行全基因组亚硫酸氢盐测序，诱导小鼠体内损伤，评估体重、粪便粘稠度和粪便含血量以及肠溃疡、隐窝结构丧失和结肠缩短。诱发GF小鼠的炎症反应，并以成年的GF小鼠作为粪便移植受体饲养在无菌隔离器中，11周处死。之前，取出组织进行组织化学、免疫组织化学和组织学评分，最后进行测序，并对相应的结果进行转绿组测序和甲基化数据集合，最后进行q-PCR分析验证，利用ATAC分析开放染色质。
结果
1 微生物群诱导的基因表达改变
为了确定共生菌群对肠道上皮中宿主基因转录的全基因组影响，文中分析了从小鼠结肠隐窝分离的肠上皮细胞（IEC）的mRNA转录组。数据分析表明，免疫基因表达没有一般性差异，FACS分析表明，在结肠隐窝IEC制剂中，免疫细胞的贡献较低，这表明免疫细胞浸润可忽略不计。
主成分分析表明，与三个GF样品相反，三个CNV重复样品之间基本相似。差异基因表达分析确定了CNV与GF样品中824个显着上调（q≤0.05和≥2倍变化）的基因和358个下调的基因，表明存在大量微生物控制基因。对358个下调基因的基因本体论（GO）分析显示细胞外基质和代谢过程富集。对824个上调基因的通路分析显示，参与有丝分裂细胞分裂的基因高度丰富，与先前研究表明GF肠细胞的隐窝更新率降低是一致的。与此发现一致，增殖标志物在CNV隐窝中显示出明显增加的表达水平。总之，本结果清楚地表明，IECs暴露于细菌会显着影响肠道上皮细胞生物学的多个方面。
图1 从GF中分离的结肠隐窝细胞与CNV小鼠的WGBS比较
2 微生物群在调节元件上引起深刻的表观遗传变化
为了确定微生物群对宿主DNA甲基化的全基因组影响，对结肠隐窝IEC进行了全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）。数据分析表明，与GF相比，CNV样品中的总体甲基化水平显着降低（图1a和图2a）。CNV样本包含约93000个LMR，而GF样本仅包含约57000。进一步的分析表明，从CNV小鼠中分离出的结肠隐窝IEC（低甲基化LMR）中，有12983个LMR的甲基化水平降低，而甲基化水平（超甲基化LMR）中只有3115个甲基化水平升高（图1b）。最终结果表明，暴露于微生物群会在诸如LMRs的调控元件上引起深刻的表观遗传变化。
由于LMRs提供了使DNA甲基化变化与基因表达变化重叠的机会，因此本研究专注于基因内LMRs。结果显示与基因表达变化相关的大多数LMR都经历了低甲基化。进一步研究300个LMR发现，这些LMR在CNV小鼠中被低甲基化并显示出明显的（q≤0.05）表达增加，因为这种关联被认为是甲基化对基因表达的直接影响（图1c）。值得注意的是，这些低甲基化的LMRs仅对三个转录因子家族（FoxA，Eklf和AP1）的结合位点表现出高度丰富的富集作用-暗示这组转录因子与微生物群相关信号的整合有关（图1d）。确实，FoxA和Eklf转录因子在肠道发育，形态和体内平衡中起着重要作用，而AP1转录因子在细胞增殖，分化，炎症，转化，细胞迁移和凋亡中至关重要。
CNV小鼠中上调的300个基因富含GO术语“小鼠结肠炎”，“人类炎性肠病”和“人类衰老”（图1e）。对这三类基因的上调基因的研究表明，暴露于共生微生物区会导致LMR脱甲基化和“早期”一组炎症基因的转录激活，这很可能会导致正常的肠内稳态。这组基因包括IFITM3（2.9倍），NOS2（15.6倍，）和PLA2G2A（15.5倍），而且这些都是微生物引起的，并参与抗菌和抗炎反应。
3 CNV小鼠的急性结肠炎会诱发DNA甲基化不足
右旋糖酐硫酸钠（DSS）的使用会改变肠道粘液层，并允许细菌在12小时内渗透到内层。本文使用DSS处理小鼠以增强IECs对微生物群的暴露。结果发现，经DSS处理的小鼠表现出肠损伤和炎症的各种症状（图2a-f）。然后，使用WGBS分析DSS相关的DNA甲基化变化。结果表明，在经DSS处理的CNV样品中，总体甲基化水平降低（图2g，图3b，c），特别是在椎板相关区域（LAD）中（图3d）。这些发现表明，单剂量DSS-甲基化组的特征在于与后期复制结构域（部分甲基化结构域（PMD））相关的大的低甲基化区域。与活性基因相关联的峡谷的超甲基化是慢性发炎的肠上皮细胞的关键特征，但无法检测到，这表明在急性炎症条件下，这并不是IEC甲基化组的整体特征。
WGBS和RNA测序数据集的整合分析确定了251个启动子，这些启动子改变了其甲基化水平并显着改变了相关基因的表达水平（≥2倍）。值得注意的是，大多数这些基因在经DSS处理的CNV小鼠中被激活，并带有在急性炎症中经历低甲基化的启动子。有趣的是，途径分析表明，上调的低甲基化基因对于免疫细胞趋化作用和炎症反应是重要的功能类别，具有丰富的功能。RNA-seq显示，在DSS样本中，免疫细胞的贡献较低，这表明观察到的基因表达变化可能是由于IECs的表观遗传重构。最终，185个基因集在结肠炎和结肠癌GO中得到了富集，这可能提供表观遗传变化，炎症和癌症之间的机制联系。
图2 急性炎症中的甲基化改变影响基因表达
4 急性结肠炎在表观遗传调控元件上引起深刻变化
进一步分析了LMR甲基化水平显示，在131133个LMR中，有20061个在CNV/DSS样品中被超甲基化（甲基化差异>0.1），而14585个被低甲基化。当从分析中排除分化相关的LMRs28时，获得了高度相似的结果（图2h），表明分化相关的LMRs28对炎症诱导的甲基化变化没有显着贡献。炎症相关的甲基化变化通常会在LMR的整个长度上延伸（图2i）。此外，隐马尔可夫模型揭示了针对引发的、活性的和基因内的增强子区段的一致的DSS依赖性低甲基化。最后，差异甲基化的LMRs明显富含富集的染色质标记H3K4me1和H3K27ac，而强烈缺失了活性启动子标记H3K4me3（图2j）。总之，这些结果表明，急性炎症在推定的增强子区域诱导了深刻的表观遗传变化。进一步的分析确定了373个基因的子集，其表达显着增加（q≤0.05），并且在DSS处理的CNV小鼠中LMR甲基化程度降低。这些基因显示出明显丰富的免疫应答途径（图2k），而181个表达水平降低的低甲基化LMR没有显示出GO富集。
与差异表达基因相关的LMRs对各种预测的转录因子结合位点表现出高度显着的富集，包括两个炎症反应的范式因子：NF-κB和AP1（图2l，m）。NF-κB结合位点在与上调基因相关的低甲基化LMR中富集了3.4倍，在与下调基因相关的低甲基化LMR中富集了5.5倍，这与NF-κB作为转录激活因子和阻遏物的双重功能一致。对于高甲基化的LMR，未观察到可比的富集，这与选择性炎症诱导的NF-κB与低甲基化的LMRs的结合一致。对于AP1结合位点，观察到甚至更强的作用，其在与上调基因相关的低甲基化LMR中富集11.3倍，在与下调基因相关的低甲基化LMR中富集8.8倍。同样，对于高甲基化的LMR，没有观察到富集。在含有NF-κB或AP1结合位点的LMR处，DSS诱导的低甲基化现象明显并延伸到LMR的整个长度上。因此，由粘膜屏障破坏引起的急性炎症在增强子区域中引起广泛的甲基化变化，这与主要炎症转录网络的活性改变有关。
5 CNV小鼠急性炎症中重叠的染色质可及性，甲基化和表达数据集
由于表达通常与染色质可及性的局部变化相关，因此进行了全基因组ATAC-测序分析，并在CNV中鉴定了469个显着差异的峰，在DSS/CNV IEC中鉴定了21925个峰。在后者中，有4122个与低甲基化的CNV/DSS特异性LMR重叠（图3a），这与391个显着上调的基因有关。这些基因丰富了小鼠（图3b）以及人类结肠炎和结肠癌（图3c）的急性和先天炎症反应，证实了本文对全基因组的甲基化分析。值得注意的是，AP1转录因子结合位点在这些ATAC-seq峰中高度富集（图3d）。例如Myd88，它与低甲基化的LMR，DSS独特的ATAC-seq峰和DSS治疗的CNV小鼠中的活化表达相关（图3e）。Myd88参与细菌感测，并充当Toll样受体信号通路（包括TLR4）的下游衔接蛋白，已知该蛋白与细菌脂多糖（LPS）相互作用。因此，结果证明了宿主肠道上皮基因的微生物群相关调控与染色质可及性有机械联系。
图3 肠结肠炎的ATAC-seq分析
6 急性炎症独立于微生物群
为了发现在CNV / DSS中观察到的表观遗传变化是否是由于细菌暴露增加所致，文中用DSS处理了GF小鼠，引起肠道损伤和炎症（图4a–c）。RNA-seq数据分析仅识别出193个基因，它们显着改变了GF/DSS与GF样品中的表达水平：114个基因被上调，而79个基因被下调。这些基因与在经DSS处理的CNV小鼠中上调和下调的基因部分共享（图4d），表明了DSS依赖的“核心”作用。相反，在CNV/DSS小鼠中受影响的基因中只有5％在GF/DSS小鼠中受到了影响。这表明在DSS处理中观察到的显着表达变化是由于微生物群引起的。
为了研究在没有微生物群的情况下与DSS处理相关的甲基化变化，再次使用WGBS。与未治疗的GF小鼠相比，排除与分化相关的LMRs28之后，鉴定出GF / DSS样品中有7388个甲基化程度较高的LMR和5628个甲基化程度较低的LMR（图4e）。WGBS分析的结果通过有针对性的亚硫酸氢盐DNA甲基化分析得到证实，并且结果进一步强调，在CNV / DSS小鼠中观察到的变化在GF / DSS小鼠中不存在。随后将单个LMR分配给特定基因，结果显示只有39个LMR在经DSS处理的GF小鼠中被甲基化不足，并显示出显着的（q≤0.05）表达增加，以及94个在DSS处理的GF小鼠中被甲基化的LMR，显示出显着表达降低（37个甲基化增加表达）。这些结果证实了在没有微生物群的情况下DSS的相当适度的作用。此外，将与改变其在GF / DSS中表达的LMRs相关的基因与与改变其在CNVDSS中表达的LMRs相关的基因进行比较时，仅发现了44个重叠基因（图4f）。这些结果表明，在没有微生物群的情况下，DSS处理会产生非常小的DNA甲基化依赖性表达变化。
最后，为了解决出生后DNA甲基化与肠道菌群之间的直接联系，进行了粪便移植实验以常规化GF小鼠，同时将它们保留在无菌隔离器中。重新建立共生菌群可显着降低在多个分析的LMR处的DNA甲基化（图4g）。这些发现证实了在稳态和炎性条件下微生物群在观察到的表观遗传程序设计作用中的关键作用。
图4 在肠道菌群缺乏的情况下，炎症性结肠的表达和甲基化变化
7 微生物引起的脱甲基化的分子机制
为了测试微生物群在结肠中引起的脱甲基作用是否以相似的方式完成，文中分析了从CNV小鼠中分离出的结肠隐窝IEC的RNA-seq数据，发现TET1不表达，而TET2和TET3（TET2 / 3）表达。CNV中的TET3（而非TET2）在GF中的表达明显高于GF。此外，用抗生素处理CNV小鼠使TET3表达降低至GF水平，而对小鼠进行DSS处理和对结肠类器官的LPS处理则上调了TET3表达水平，这与肠道菌群有关。
随后，从Tet2/3fl/fl和KO小鼠的结肠中分离出隐窝IEC，并进行WGBS。结果表明，在Tet2 / 3 KO样品中，总体甲基化水平显着升高（图5a，图6d–f），这已通过微生物群诱导的低甲基化LMR中的6个进行亚硫酸氢盐测序而得到进一步验证（图5a，5b）。这些结果表明，TET2 / 3在微生物群诱导的去甲基化中起关键作用
对KO小鼠中与高甲基化LMR相关的六个基因的RT-PCR分析显示，在所有突变动物中，三个基因的转录均显着减少（图5c），表明在这些调控序列上TET2 / 3介导的去甲基化起着直接作用在基因诱导中的作用。其他三个基因在突变小鼠中表现出可变表达，这表明这些LMR不能调控其相关基因，或者涉及其他调控元件。
将Tet2 / 3fl / fl小鼠与在肠道特异性Villin启动子控制下表达CRE重组酶的动物杂交，该启动子可以通过将他莫昔芬施用于动物而被激活（CreER）。对五个DSS诱导的次甲基化LMRs进行了针对性的亚硫酸氢盐测序，结果表明与Tet2 / 3fl / fl对照小鼠相比，在DSS处理的TET2 / 3 双KO小鼠中，所有测试的LMR均未经历去甲基化（图5d）。此外，疾病活动性、体重减轻和组织学分析证明，Tet2 / 3突变体比Tet2 / 3fl / fl小鼠更易受DSS治疗（图5e–h）。这与微生物群依赖的去甲基化由TET2 / 3介导的观点相符，并且与WT动物相比，突变小鼠对炎性攻击的应答降低。
图5 微生物诱导去甲基化的分子机制
讨论
肠道微生物组的多样性和组成已被研究了十多年，但它们在维持组织稳态和影响宿主表观遗传学方面的确切作用仍知之甚少。已知DNA甲基化在控制肠内稳态和分化中起重要作用。文中已经研究了肠道菌群对稳态和急性炎症下IECs的表观遗传景观的影响。虽然先前已经证明肠道菌群会影响一小部分基因的DNA甲基化，但在这里展示了菌群如何在全球范围内塑造IEC甲基化组，从而有助于肠道健康和体内平衡。研究结果支持推定的增强子甲基化和微生物群之间的直接联系。
在本文的分析中确定的LMR与识别年龄相关的肠道DNA甲基化变化的成熟相关差异甲基化区域（DMR）以及区分Lgr5阳性干细胞和分化的分化相关DMR均不同。在这项研究中鉴定出的LMR显示出转录因子结合位点的高度丰富，例如被称为“开创性”转录因子的FoxA家族成员，以及在肠道发育和体内平衡中起主要作用的KLF4和KLF5。最近，有研究表明，KLF4也是一种“开拓性”因子，可在染色质打开之前直接与TET2相互作用并将该酶募集到特定的DNA位点。此外，对与甲基化不足的LMR相关的数百种共生菌激活基因的途径分析显示，与结肠炎和IBD相关的基因明显富集。已知这些基因中的许多基因，例如IFITM3，NOS2和PLA2G2A，都参与保护肠道免受炎症反应。因此，肠道生理发育过程中DNA甲基化程序的改变可能会导致“早期前哨”反应基因的上调，这对于正常肠道的动态平衡很重要。研究的发现GF小鼠没有激活这组反应基因，这为为什么这种小鼠对DSS诱导的炎症更敏感提供了进一步的解释。稳态条件下的微生物可能引发了生命后期发炎的疾病中基因表达的变化。在不同细胞谱系的发育过程中观察到了增强子的表观遗传启动。重要的是，这是通过基因甲基化分析而不是基因表达分析揭示的，从而强调了DNA甲基化在准备细胞应对未来挑战中的作用。
炎症是一种保护性反应，主要是面对和消除病原体，是生存所必需的。先前结果已经表明，慢性炎症信号建立了表观遗传程序，该程序使结肠IEC中的一组特定基因沉默，这有助于炎症诱导的转化。该过程代表了人类结直肠癌的一个显着特征，可用于正确分类结直肠癌样品。在当前的研究中，结果表明，CNV小鼠对急性结肠炎的表观遗传反应不同于在慢性炎症中检测到的反应。在急性炎症中，与慢性炎症相比，PMD比在慢性疾病中更为明显，并且未检测到甲基化高。
本研究结果还提供了成千上万的未表征微生物群调节的LMR /推定的增强子图集，这些图谱描述了染色质的高度可及性。以前曾有人提出，与微生物群相关的影响与组蛋白修饰的改变相比，与总染色质可及性的改变更多地相关。本研究结果表明，IEC基因的微生物群依赖性调节与DNA甲基化和染色质可及性具有机械联系，如ATAC-seq所确定。这在涉及生理和人类疾病的肠道宿主基因的调控中提供了另一个重要的层。
结论
本研究发现暴露于共生菌群会导致调节元件上的局部DNA甲基化变化，这是TET2 / 3依赖性的，而且这最终激活了一组“早期哨兵”反应基因，以维持肠道的动态平衡。此外，暴露于右旋糖酐硫酸钠引起的急性炎症中的微生物会导致DNA甲基化和染色质在调节元件上的可及性发生变化，从而导致基因表达程序发生改变，这些基因表达程序富含结肠炎和结肠癌相关功能。最后，通过采用遗传干预，表明微生物群诱导的表观遗传程序对于体内适当的肠道稳态是必要的。
你可能还喜欢
联系客服
