科研 | ES&T: 含氮废水处理系统中固氮菌的富集

编译：橙，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

人为固氮对维持全球77亿人口至关重要，长期人们以来一直致力于找寻更便宜、更环保的可替代哈伯法（Haber Boschprocess）固氮的工艺。在这项研究中，作者开发了一种新的固氮方法，通过在含氮废水的反应器中富集自生固氮细菌（NFB）进行生物固氮。

反应器每天以每升11.8毫克氮的速率固定了相当数量的氮，这一速率与最近的“突破性”固氮技术接近，远高于在低碳氮比的反应器中观察到的速率。使用qPCR对nifH（用于鉴定固氮微生物的功能基因）和16srRNA基因进行定量，nifH基因在固氮反应器中富集了10倍，达到细菌总数的13%，16S rRNA基因扩增子序列分析表明，巴氏固氮梭菌（Clostridiumpasteurianum）在微生物群落中占据主导地位（19%）。

作者设想，这些富含氮的生物有可能被用作生物肥料，并且处理后的废水可通过相对简单的后处理工艺排放到环境中，进一步减少对环境的危害。

论文ID

原名：Enrichment of nitrogen-fixing bacteria in a nitrogen deficient wastewater treatment system

译名：含氮废水处理系统中固氮菌的富集

期刊：Environmental Science & Technology

IF：7.149

发表时间：2020.2

通讯作者：Carolina Ospina-Betancourth

通讯作者单位：英国纽卡斯尔大学

图文摘要

实验设计

接种物：反应器接种40毫升污泥，这些污泥分别来自四个不同的地点，并按相同比例进行混合。第一个样品是从工业和生活废水处理厂（BS）中获得，第二和第三个样本一家造纸厂废水处理厂收集，第四个污泥样本来源是一个完全厌氧的农场发酵池。

反应器的设置和运行：反应器加入合成废水（补充化学元素）在30°C下运行85天，初始工作容积为0.8L，水力停留时间（HRT）为48小时。对照处理在培养基中加入(NH₄)₂SO₄，C:N:P比设置为100:5:1.5（低C:N），第二个处理不含任何氮源，C:N:P比为100:0:1.5（高C:N），并对进水、混合液和出水样品进行理化指标分析。

乙炔还原法和¹⁵N₂标记同时测定固氮量，并进行DNA提取分析微生物群落组成，主要包括对固氮基因nifH及16srRNA基因进行qPCR定量及高通量测序

结果

1 废水处理效率

不同反应器（高、低C:N）的COD去除率没有显著差异，在第85天，高C:N反应器的COD去除率为73±4.8%（平均值±标准值），低C:N反应器对COD的去除率为83±12.6%。因此氮的有效性并不限制有机物的去除。低、高C:N处理的pH值分别为6.29±0.8和6.31±0.78。低C:N处理的平均溶解氧浓度为1.6±2.2mg/L，高C:N处理的平均溶解氧浓度为1.18±2mg/L。

2 高、低C:N反应器中固定的氮

在高C:N反应器中，运行85天后，总氮（主要以有机形式存在）从每升少于10毫克增加到280±57毫克（fig.1）。总的来说，在高C:N反应器，每天产生的有机氮（生物量）的平均速率为1.6±0.5mg/L。在低C:N反应器中，同期后的总氮为175±57 mg N/L，其中约一半（80±14 mg N/L）为铵态氮（fig.1）。两个处理的硝酸盐（低于每升6毫克氮）和亚硝酸盐（低于每升0.6毫克氮）含量都很低。

图1. 运行85天后，低C:N（对照）和高C:N处理的进水、混合液和出水中亚硝酸盐、硝酸盐、铵和有机氮的含量。

3 高、低C:N反应器中氮固定

采用¹⁵N₂标记或乙炔还原法，低C:N反应器的固氮率为零。在培养过程中第51小时高C:N反应器以每毫升每小时12到20 纳摩尔N（每天高达11.8mg氮）的速率固定氮（fig.2），乙炔还原试验给出了类似的结果，速率为每毫升13至25 纳摩尔C₂H₄。乙炔还原率与氮气固定率之比称为R比，在固氮反应器中，其变化范围为1.2至1.5。

图2. 在反应器中培养0、24和51小时后，低C:N（对照）、高C:N和阳性对照维氏固氮菌（A.vinelandii）处理的¹⁵N₂固定率。

4 高、低C:N反应器中nifH 和16S rRNA基因丰度

不同处理反应器中16S rRNA基因的数量都随培养时间的增加而增加（fig.3a）；基因拷贝数被用作生物量量化的指标，并且在高C:N和低C:N处理中分别增加了25倍和19倍（相对于第0天），低C:N处理的16S rRNA基因比高C:N处理少（29%），实验和对照反应器之间的挥发性悬浮物（VSS）没有差异。每微升接种物含有nifH拷贝数3.9±0.2 x 10⁶，运行85天后，高C:N处理含有nifH拷贝数8±3.4 x 10⁷，而低C:N每微升含有nifH拷贝数6.8±3.2 x 10⁶（fig.3b）。假设每个细胞含有4.2拷贝数的16S rRNA和1拷贝数的nifH，可以计算出反应器中自生固氮细菌NFB的数量；它占固氮反应器中生物量的约15%，但在低C:N时从16%降至1.5%（fig.3c）。

图3. 高、低C:N反应器中a. 16S rRNA基因b. nifH基因c. 自生固氮细菌NFB的相对丰度变化情况。

5 微生物群落分析

16S rRNA基因序列聚类分析，接种物和第0天的所有样品形成一个单一簇，两种处理（低C:N和高C:N）的样品形成另外两个不同的团簇（fig.4）。第0天采集的样品微生物群落结构具有高度相似性（约80%），所有反应器中的微生物群落的多样性在运行85天后几乎无法区分。

图4.接种物样品中微生物群落的比较（Bray-Curtis相似性）

即使在门的水平上进行评估，低C:N反应器和固氮反应器在运行85天后也发展出完全不同的群落（fig.5a）。高C:N反应器中最丰富的3个门分别是Chloroflexi（26±7%）、Proteobacteria（24±6%）和Firmicutes（22±6%）。在低C:N反应器中，以Bacteroidetes（35±0.3%）、Actinobacteria（31±4%）和Proteobacteria（21±1%）最为丰富。高C:N反应器中最丰富的Clostridium pasteurianum（19±5.4%），属于Firmicutes。在低C:N反应器中，最丰富的微生物是Corynebacterium sp.，占27±2%（fig.5b），它是一种来自放线菌门的兼性厌氧菌，常见于污水中，这个属包含固氮和异养硝化菌的物种。

图5. 细菌群落组成a. 门水平b. 属水平

针对扩增序列进行dada2降噪处理，其中6个ASVs（来自nifH功能序列）物种注释结果来自于巴氏固氮梭菌（C. pasteurianum），16S rRNA基因和nifH功能基因测序结果均表明一株新的梭菌出现在高C:N反应器中。未分类的nifH-ASV-2与同源nifH序列进行比对，并在系统发育邻域连接树中进行比较（fig.6），结果表明该序列与Clostridium sp.，C.pasteurianum和ASV-12同源性较高，序列相似度接近66%，与NCBI核酸数据库比对结果显示，该序列与分离自稻田土壤水稻植株残体中的拟杆菌门下的Paludibacterpropionicigenes WB4序列相似度为83%。nifH功能基因可在序列高度变异的基因组中存在于多拷贝中，据报道巴氏杆菌有6个不同的非同一拷贝，核苷酸序列同源性在68-99%之间。事实上，尽管ASV-12与C. pasteurianumX07474参考序列聚在一起，但它只有90%的核苷酸序列同源性。

图6. 高C:N反应器的nifH-ASVs（以灰色突出显示）的系统发育树及其最近鉴定的参考序列。Bootstrap值1000，比例尺表示序列分异距离。

讨论

反应器在没有任何添加外来氮源的情况下运行，可以产生富含自生固氮细菌生物质，并将废水处理到与添加氮的反应器相同的标准，并确信氮来自空气，而不是来自回收的生物质，因为在反应器的废水中几乎没有发现铵或氧化氮化合物。已经证明自生固氮细菌能够提高植物（如谷物和甘蔗）的氮吸收，因此这种类型的污泥可以用作生物肥料。此外，一些自生固氮细菌可以在某些非豆科植物上进行定殖，并形成促进植物生长和产量的共生关系。废水处理污泥的元素组成可作为后续研究的主题，以评估其作为生物肥料的适用性。

与传统的氮还原废水处理系统相比，废水中微生物进行固氮的策略是可持续的，运行成本更低；它不需要额外添加氨，并且在低溶解氧浓度（小于0.5 mgO₂/L）下运行。通常情况下较低的溶解氧浓度被认为有利于自生固氮细菌生长，并明显降低运行成本（占活性污泥厂用电量的70%以上）。水力停留时间和污泥停留时间对自生固氮细菌选择的影响尚未阐明，应进一步研究以优化其繁殖。作者在实验中观察到固氮率（11.8mg N/L/d）与反应器中的理论固氮量（9.9mg/L/d）和其他突破性固氮技术中的报告相当。例如在无机物生物固氮杂交系统中，利用黄杆菌自养的纯培养物和通过催化水裂解（利用可再生能源）获得氢，获得了每天455 12 mg N的固氮率。然而，这一过程的较高速率需要考虑催化剂的成本和稳定性以及保持纯培养物的困难。

乙炔还原率与氮气固定率之比称为R比，虽然R比的理论值是3.2，但它的变化范围是1到30。因此，在外推数据以获得生物固氮的估计值之前，用¹⁵N₂法校准乙炔还原法是非常重要的。以往在废水处理系统中评价固氮的工作，仅用乙炔还原法估算固氮率。利用nifH基因对细菌进行分类具有挑战性，因为nifH基因可以水平转移，因此其系统发育与16S rRNA基因系统发育的一致性较差，而且由于其内部存在多个不同的nifH拷贝，使得分类更加复杂。

据估计，全球造纸和制浆工业每年产生的废水量至少为39.01亿升，因此这些高碳氮废水每年可提供至少91.38吨氮的固定能源，这一数量仅相当于每年用Haber-Bosch法固定的一小部分，然而这种新的固氮策略可用于高C:N的情况，例如来自其他行业的废水，如酿酒厂等。对于买不起化肥的发展中国家的农民显得十分重要，反应器中nifH与假定细菌总数的比率比Bowers等人报道的比率低10倍，这可能受实验条件（废水成分、水力停留时间、溶解氧水平等）的驱动，但也可能受到分析方法的影响，如DNA提取，引物选择等。

在这项工作中，作者展示了在高碳氮比环境下运行的废水处理系统在不影响处理效率的情况下固定较为可观氮量的能力，并证明了一种新的固氮策略，不注重生物量增加的含氮废水作为废水污泥的增值方法。哈伯法（Haber Boschprocess）固氮工艺比生物固氮的能量效率高2至4.5倍，然而，需要注意的是一些不发达地区生产力水平有限，并且不合理施用化用目前已造成的一系列环境问题。氮的挑战包括化肥有效利用来保障粮食安全，同时减轻废水处理系统中的残余污泥的污染影响，富含自生固氮细菌有助于将高碳氮废水处理系统作为一种潜在的氮肥来源。总之，生物技术的开发为缓解依赖化石燃料提供能源的工艺固定氮的提供了一种创新的可持续方法。

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