编译：Mushroom，编辑：小菌菌、江舜尧。
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相似的菌株之间即使只有少数基因的差异也可能出现关键性表型的变化，其原因就是所谓的微生物基因组结构变异（SVs），它们普遍存在于人体肠道菌群中，可存在于不同类群的微生物中。SVs有基因编辑和产抗生素的功能，并且缺乏管家基因，这表明它们在微生物生存过程中可发挥重要作用。通过对同一SV中的基因研究发现，SVs与宿主疾病风险因素之间关系密切，并且SVs和宿主健康之间存在某些可能的机制联系，例如Anaerostipes hadrus（A.hadrus）中具有编码复合肌醇分解代谢和丁酸盐生物合成的SVs，其存在与宿主发生代谢疾病风险较低相关。总而言之，本实验的结果揭示了SVs与微生物生存和宿主健康密切相关。
论文ID
原名：Structuralvariation in the gut microbiome associates with host health
译名：肠道菌群的结构变化对宿主健康的影响
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2019.03.27
通讯作者：David Zeevi和Eran Segal
通讯作者单位：以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所计算机科学系、应用数学系和分子生物学系以及美国纽约洛克菲勒大学物理与生物研究中心
实验方法
实验设计
结果
1使用ICRA进行精确的宏基因组读取分配
为了准确地检测出SVs，我们找到了一种正确的宏基因组读取分配方法，克服了不同微生物之间大量重复的问题。通过分析从以色列收集的887名健康受试者的微生物组和临床数据，发现超过15%的宏基因组读数在映射到3953个细菌基因组的数据库时被分配到了多个参考基因组中。为了解决这个问题，我们设计了“基于迭代覆盖的读取分配”（ICRA）算法，它通过准确的读取分配、微生物测序覆盖深度和微生物相对丰度将映射读数进行了重新分配。ICRA会充分覆盖样本中的SVs，否则，SVs可能会偏离估计的相对丰度，甚至可能会出现错误。
为了测试ICRA的性能，我们验证了该算法的两个关键部分：一是它可以解决模糊的读取分配，二是它推断的细菌相对丰度具有准确性。
2 SVs在微生物群落中普遍存在
为了系统地描述健康人体微生物组的结构变化，开发了SGV-Finder，并将其应用于ICRA校正后的3953个有代表性的微生物基因组参考数据库中。SGV-Finder分析了所有样本中微生物基因组的存在比例并以此作为根据来描述SVs。
对于缺失SVs和可变SVs，前者在25-75%的样本中发生缺失，后者在样本中具有不同的存在比例。在这两种SV类型中，片段是基于共现（缺失SVs）或相关性（可变SVs）连接起来的。
在56个细菌中检测到了2423个可变SVs和5056个缺失SVs。在6个细菌门和1个古细菌门中检测到了SVs，并在每个平均大小为1400-1860个碱基对的细菌中有5-241个SVs。可变SVs和缺失SVs分别占微生物基因组的0.3-8.4%和5.0-26.9%。这种明显的大小差异可能暗示了两种类型SVs形成的内在差异，在887个样本中，769个携带了球状梭菌群的SVs，727个携带了A.hadrus的104个缺失SVs和33个可变SVs，668个携带了单形拟杆菌的SVs。我们在每个受试者身上都检测到了SVs，并对其进行了分析，结果表明这种变异是普遍存在的。
3 SV在不同的人群中流行
为了探究SVs存在的普遍性及其生物学意义，应用ICRA和SGV-Finder对来自荷兰的不同生活环境的1020个样本进行分析，发现具有SVs的56个细菌中，两种SVs的比例分别为72.9%的可变SVs（0-99.1%）和78.3%的缺失SVs（35.3-94.5%）。值得注意的是，对于75%的微生物，尽管所研究人群的遗传背景、生活方式和饮食偏好以及算法、机构和工作人员均不同，但仍有超过70%的SVs是一样的（图1a）。
有些细菌的SVs，如瘤胃球菌属，在群体间的一致性非常低（在超过10个可变SVs上有27%的重叠，总计23kbp；图1a），而有些细菌如粪副拟杆菌的SVs，则表现出高度的一致性（46个变异SVs中有95%的重叠，共281kbp；图1a）。这说明某些SVs是受地理局限性或特定种群环境因素影响的。
4 SVs具有个人和生活环境特异性
通过分析不同受试者之间可变SVs和缺失SVs的相关性来检验SVs在人群中的可变性，发现不同个体的SV分布差异较大，可变SVs和缺失SVs的中值相关系数分别为0.02和0（图1b，c）。相反，SVs在同一个体内高度稳定，甚至在超过一年的时间内，可变SVs和缺失SVs的相关中值仍为0.89和0.66（图1b，c）。进一步对同居的个体、没有住在一起的兄弟姐妹以及父母与孩子的数据分析，发现与两个随机受试者相比，他们共享SVs的程度明显更高（可变和缺失SVs的平均Spearman相关性分别为0.45和0.16；图1b，c）。有趣的是，与同居的受试者相比，亲属微生物组SV的相似性要低得多（图1b，c）。这一结果进一步支持了我们之前的发现，即环境在决定微生物组组成方面比基因更重要。
图1 SVs在不同的群体中存在，并且随着时间的推移在个体中保持稳定。
（a）不同生活环境的所有微生物中重复SVs的基因组长度重叠。不同受试者（绿色，n = 704）、同一受试者（蓝色，n = 21）、同居受试者（黄色，n = 39）、兄弟姐妹或父母和孩子（“亲戚”，红色，n = 38）之间（b）可变或（c）缺失SV的相关性箱形图。
5 SVs与微生物生存的关系
通过在可变SVs、缺失SVs和保守区域中标注基因功能，分析SVs中富集或缺失某些基因来探寻SVs的功能，并寻找这些区域中过表达和低表达的KEGG模块。利用KEGG BRITE层次结构，发现SVs“管家”模块如核苷酸和氨基酸代谢或碳水化合物和脂质代谢显著减少，并在保守区域显著富集（P< 2×10−5；图2a-c）。相反，被归类为ABC-2型和其他运输系统模块在可变SVs中显著富集（图2a）。此外，IV型分泌系统（T4SS）模块也在SVs中富集（P<2×10-5；图2a、b），并在保守区缺失（P<2×10-5；图2c），这表明和T4SS相关的细菌接和系统与变异性显著相关，进一步证明了SVs是微生物生存和细菌形成的工具。
此外，SVs还富集了未指定功能的基因（P < 2×10−5；图2a，b，红星）。因此，我们对基因功能注释进行了文本充实分析。噬菌体、质粒和转座子相关基因，以及编码水平基因转移（HGT）机制的基因在SVs中富集，而在保守区缺失，表明这些机制在SVs的形成中发挥了重要作用。与HGT机制相关的Pfam基序分析也证实了这一点（q< 10−4）。此外，可变SVs中含有产抗生素的基因（q< 0.005），缺失SVs中含有基因编辑相关基因（q < 0.05），表明SVs可作为微生物工具与其环境相互作用。为了进一步确定SVs对微生物生存的作用，寻找与其自身相关的SVs，利用DNA复制所产生的DNA拷贝数差异，来估计具有足够覆盖度和完整参考基因组的21个菌株的细菌生长速率，结果发现这些生长速率与同一细菌中44个缺失SVs之间有高度显著的相关性（P< 3×10−5；图2d），说明某些SVs与细菌的生长繁殖密切相关。
图2 SVs与微生物的生长速率和特定功能有关。
KEGG23模块在（a）可变SVs、（b）缺失SVs和（c）保守区域倍数变化的统计学显著性。（d）对21个微生物中缺失和保留的1756个SVs细菌生长率（PTR26）进行比较，用双面Mann-Whitney U检验对中值的差异绘制出统计学显著性。
为了探究SVs与微生物生存的潜在机制，本研究系统地研究了与生长相关的缺失SVs基因，发现了与所有SVs相似的功能特征，包括基因编辑、转座子、HGT相关基因的富集（q<0.05）和管家功能的缺失，以及未知功能基因的显著富集（P< 10−5）。还进一步研究了两个与细菌的生长呈显著正相关和负相关的SVs。值得注意的是，负相关的SV包含鞭毛蛋白基因、鞭毛钩相关蛋白基因和脂多糖（LPS）胆碱磷酸转移酶基因。鞭毛蛋白和鞭毛钩蛋白可引起强烈的免疫反应；LPS胆碱磷酸转移酶可将胆碱磷酸连接到细菌的LPS分子上，从而增加c-反应蛋白介导的先天性免疫清除。所以这些蛋白的存在可能会抑制微生物的生长。相比之下，与微生物的增长速率呈正相关的SV包含几个假设基因，如抗生素转运系统ATP结合蛋白基因，它的存在能使某些人类宿主产生抗生素耐药性从而获得选择性优势。
总之，SVs与常见的接合、转位和噬菌体溶原性机制相关，在复杂的生态系统中，微生物的进化可能会受到SVs的强烈驱动，从而对微生物和宿主产生影响。
6 SVs与人类健康的风险因素有关
为了探索SVs与人类健康的关系，将可变SVs和缺失SVs的丰度与健康指标和风险因素，即平均动脉血压（MAP）；总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇；腰围；重量；体重指数（BMI）；一周的中位血糖水平；糖化血红蛋白百分比（HbA1c%）和年龄结合起来，发现其与可变SVs和缺失SVs有显著相关性，相关性指数分别为81（图3a）和43（图3b），表明SVs对人类健康有重要影响。
通常情况下携带与某些风险因素相关SVs的微生物，其相对丰度也与相同的风险因素相关。例如，我们发现，在A.hadrus中有5个缺失SVs与较低的BMI、体重和腰围相关，与较高的HDL胆固醇水平相关（图3b）。而实际上A.hadrus的相对丰度与体重（P < 10−5）、腰围（P < 10−5）、中位血糖水平（P < 10−4）和BMI（P < 0.005）呈负相关，与HDL胆固醇水平呈正相关（P < 10−7）。由此可见，特定的SVs与风险因素之间的关系能够反映出其发生作用的特定区域和机制。然而，某些细菌SVs的相对丰度与宿主表型有着相反的联系。例如， 粪球菌属的3个可变SVs与多个风险因素呈负相关（图3a），而粪球菌属的丰度与体重（P < 10−3）和BMI（P < 0.05）呈正相关。直肠真杆菌中多个可变SVs与年龄呈正相关（图3a），而直肠真杆菌 的相对丰度与年龄呈负相关（P< 10−6）。普氏粪杆菌KLE1255中的2kbp缺失SV与周平均血糖水平呈正相关（图3b），尽管在我们的研究中普氏粪杆菌的丰度与此无显著相关性，但在荷兰不同生活环境群体的样品研究中发现它与以高血糖水平为特征的Ⅱ型糖尿病呈负相关。这些SVs和风险因素之间看似矛盾的联系进一步表明，与分类学水平相比，SVs代表了一个有助于了解宿主与微生物相互作用机制的特殊信号。
为了测试这些关联的准确性，我们对来自荷兰不同生活环境群体的样本进行了ICRA，并计算了SVs的覆盖率，评估了其与不同生活环境中宿主风险因素之间的关联，并与本研究中发现的关联进行比较。值得注意的是，尽管在基因、饮食偏好和生活方式中存在群体间差异，但在这两组微生物关联中，仍有超过三分之一是重复的，而剩下的77人中，只有4人与以色列群体中相同的相关性显著相反（图3）。
图3 SVs与疾病风险相关，在另一个类群中也是。
疾病风险因素与可变SVs或缺失SVs之间统计学显著相关热图。在生命线群体中，星星，重复关联（黄色）、不同变量重复（橙色）、反向关联（灰色）。带条纹的星星，来自相同细菌的一排，为了展示而折叠起来。
7 SV与风险的相关性有助于阐明机制
与细菌适应生存一样，研究与疾病风险相关的SVs基因有助于揭示其与风险之间相关性的机制。虽然许多SVs含有未知功能的基因，但可发现与风险相关的SVs中编码了一些有趣的基因功能，如假单胞菌中存在的11kbp缺失SV与较高的糖化血红蛋白相关，并且含有该区域的受试者微生物丰度也较高（P< 0.02），之前的研究已经证明，在饮食引起餐后高葡萄糖反应后，微生物丰度会增加。瘤胃球菌中的6kbp可变SV与中位血糖水平呈负相关（图4a），其编码噬菌体相关蛋白的功能基因及未知功能的附加基因，表明该SV是一种原噬菌体并具有附加功能（图4b）。因此，这些未知功能的基因都与宿主的葡萄糖代谢有关。
A.hadrus中31kbp的缺失SV与较低的体重、腰围、BMI和较高的HDL胆固醇显著相关（图4c），并且得到了很好的注释。这证明使用SGV-Finder检测能够揭示其潜在机制。该SV还编码了肌醇的分解代谢和丁酸盐的生物合成以及7个糖转运蛋白，可将肌醇或d-手性肌醇代谢为（i）甘油磷酸（甘油醛-3-磷酸的前体）和（ii）-3-氧丙酸，乙酰辅酶A的前体。并将3-羟基丁酰辅酶A代谢为丁酸盐（一种短链脂肪酸，SCFA），同时氧化电子传递的黄素蛋白。这两条通路是通过A.hadrus基因组中其他编码反应连接的（图4d，e）。7个糖转运蛋白中1个是山梨醇特异性转运蛋白，6个是未分配给靶标的转运蛋白。肌醇分解代谢途径与糖酵解和乙酰辅酶A复合物结合产生能量，丁酸盐复合物随即消耗能量产生丁酸，对A.hadrus的能量代谢具有积极作用，净获2个ATP-和2个NADH-等价分子。
在荷兰不同生活环境群体的个体中也存在该SV，它与宿主表型关系密切，并且具有SV的荷兰个体也表现出较低的BMI、体重和腰臀比，这意味着该SV与疾病风险之间存在着一种普遍的联系。
图4 风险相关的SVs具有功能多样性的基因。
（a）散点图显示了每周葡萄糖中位数水平与瘤胃球菌中6kbp可变SV丰度（n = 373）的关系。（b）顶部，瘤胃球菌基因组区域（x轴）的标准化变异（y轴）。底部，基因位置（箭头）根据功能（顶部图例）着色。（c）A.hadrus基因组中31kbp缺失个体（蓝色，n = 213）和未缺失个体（栗色，n = 468）的体重箱线图。显著性由双侧Mann-Whitney u检验确定。（d）A.hadrus基因组区域（x轴）的缺失率（y轴）。底部，基因位置（箭头）按功能（底部图例）着色。（e）SV中编码的将肌醇转化为丁酸盐的代谢途径。
结论
结论
基因变异在生物界中普遍存在，细菌即使发生少量的基因变异也会出现毒力、抗生素耐药性或宿主代谢疾病等表型的变化，因此基因变异对微生物及其宿主都非常重要。由于肠道微生物参与多种宿主代谢过程并与多种疾病相关，因此这种变异可能对人类病理生理学至关重要。本研究检测了来自887个人类肠道微生物组样本中56个细菌的7,479个SVs，发现它们普遍性存在，并具有独特的基因功能，与细菌的生长速率相关，在个体内具有稳定性。其中124个SVs与多种疾病风险因素之间具有重要联系，从而证明了SVs对人类宿主具有潜在作用。此外，还分析了荷兰不同生活环境的群体，发现两个群体的所有细菌SVs中有76%的重复，以及40%风险因素相关，这表明一些变异可在不同的种群之间共享。从而证实SVs与人类健康高度相关。
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