编译：番茄加牛腩同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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四环素（tetracycline，TET）在医学，渔业和畜牧业中普遍使用，导致其在水生环境中被频繁检出且浓度很高。该研究通过将幼龄期斑马鱼暴露于四环素培养基中进行为期一个月的实验，发现四环素能增加斑马鱼体重，在肝脏中产生脂质空泡影响肝脏微结构，此外还通过脂质组学和非靶向代谢组学进行了进一步探究，进一步对斑马鱼进行肠道菌群的检测发现TET对肠道菌群也产生了显著影响。揭示了抗生素对肠道菌群和宿主健康具有潜在深远影响。对于阐明环境中抗生素水平影响宿主健康和代谢水平具有重要意义。
论文ID
原名：Long-term exposure to TET increases body weight of juvenile zebrafish as indicated in host metabolism and gut microbiome
译名：长期暴露于四环素会增加斑马鱼的体重，体现于宿主代谢和肠道微生物组
期刊：Environment International
IF：7.943
发表时间：2020.03
通信作者：董武，方明亮
通信作者单位：内蒙古民族大学&新加坡南洋理工大学
实验设计
结果
1 暴露于TET使斑马鱼体重增加，肝脏微结构发生变化
将斑马鱼暴露在在以1和100 µg/L浓度的TET，定期检测斑马鱼的生长情况。与对照组相比，作者在TET暴露组中未观察到任何明显的畸形。有趣的是，与对照相比，作者观察到1和100 µg/L 浓度水平的TET中斑马鱼的体重显著增加（图1a）。但是，体长没有变化（图1b），这表明体重指数（BMI）增加。具体来说，一个月后对照组的平均日增重分别为0.2±0.07 mg（1 µg/L）和0.8±0.09和0.6±0.1 mg（100 µg/L）。三组的体长都达到了大约3 cm。
由于暴露于抗生素和体重增加可能会改变肝脏功能，因此作者接下来对斑马鱼肝脏组织进行了组织病理学分析。肝脏H＆E染色切片发现TET处理的斑马鱼肝脏组织核染色质浓缩和脂质液泡生成（图1c）。在斑马鱼肝脏中观察到的效果可能与体重增加有关，尤其是在肝脏中观察到的液泡是脂质蓄积的迹象，脂质堆积直接与体重增加增加有关。
上述结果表明，如果从幼年期环境中开始暴露于TET，很可能会导致成年鱼体重增加。该研究与之前关于啮齿动物早期暴露于抗生素引起的体重增加的几项研究一致。与对照组相比，用75 mg / kg / day 剂量TET处理大鼠可导致较高的BMI和体内较低水分，这表明与对照组相比，体内脂肪的蓄积量更大。据作者所知，这是首次报告在鱼动物模型中进行TET暴露会导致体重增加。
图1 TET暴露对斑马鱼生长和肝脏结构的影响。（a）平均日增重，（b）平均身长，（c）肝脏H＆E染色切片。
2.暴露于TET使斑马鱼肝脏中脂代谢紊乱
体重增加和肝脂质液泡形成可能与肝脏脂质蓄积有关(Jin et al., 2016),作者进行了脂质组学分析，以比较对照和TET处理的斑马鱼之间的肝脂质组组成。结果显示，暴露于较高剂量的TET时，脂质的响应特性更高。例如，在100 µg/L TET暴露下肝脂质紊乱比在1 µg/L TET暴露下脂质紊乱高1.2倍（图2a）。分别鉴定到了了甘油磷脂（glycerophospholipid），甘油脂（glycerolipid）和鞘脂脂质（sphingolipid lipid）的99、119和106个脂质（详见图2b，表S3-S5）。有趣的是，在肝脏中，暴露于100 µg/L TET剂量中，斑马鱼甘油三酸酯（TAG）的水平显著增加1.5倍，而鞘磷脂（SM）的水平仅轻微的增加。图2c和表S3中显示了一些代表性的TAG。在小鼠中，生命早期进行抗生素处理观察到TAG合成途径的上调，这与本研究结果是一致的。另一项研究报道了小鼠暴露于红霉素后，体重增加和肝TAG水平升高。有趣的是，尽管鱼类与啮齿动物抗生素的接触途径不同，但在TET处理下，我们在斑马鱼中观察到了类似啮齿动物的肝脏TAG积累。
图2 斑马鱼暴露于1和100 μg/L TET时肝脏中的脂质变化。（a）通过整体质谱分析检测到的上调和下调的脂质。（b）脂质类别占总鉴定脂质的百分比。（c）TAG相对于对照的倍数变化。
3. 暴露于TET，斑马鱼肝脏中的代谢变化
为了探究与TET导致的肥胖和肝脏异常所相关的代谢变化，作者进一步进行了非靶向代谢组学分析。较高剂量的TET会引起斑马鱼肝脏中产生更多的代谢产物。例如，在ESI（+）和ESI（-）模式下，在100 µg/L的TET暴露下观察到代谢特征明显失调，分别是1 µg / L暴露下的1.4和1.3倍（图3a）。
通过MS / MS数据和保留时间匹配鉴定并确认了总共35种代谢物，这些代谢物在暴露于两种剂量TET中发现肝脏代谢明显失调（图3b和表S6）。对于代谢通路分析，代谢通路的富集分析突出显示了在1 µg / L的TET下，α亚油酸和亚油酸的代谢以及苯丙氨酸和酪氨酸的代谢通路发生了改变；在100 µg / L的TET下，甲基组氨酸和蛋氨酸的代谢途径发生了变化（图3c和S2）。
有趣的是，之前已经报道某些代谢变化与肥胖症和肝脂肪蓄积有关。在脂质组学分析中观察到的TAG水平升高（图2b和c）可能是由于脂肪酸（FAs）水平失调导致的。之前的研究发现，小鼠的脂肪酸，尤其是肝脏中的棕榈酸与TAG水平的升高有关。脂肪酸是TAG合成的上游，其可以调节TAG的积累并且已知与肥胖相关的肝脏异常有关。此外，已知在经TET处理的斑马鱼肝脏中高度上调的蛋氨酸相关代谢物（包括S-腺苷蛋氨酸）与BMI相关。蛋氨酸代谢失调还与斑马鱼的肝脂肪变性有关，这解释了蛋氨酸代谢与肝脂质蓄积之间的可能联系。此外，众所周知，一些反应代谢物，例如酪氨酸，4-羟基肉桂酸和α-亚麻酸是由肠道菌群产生/转化的。因此，暴露于TET后肠道微菌群的组成和功能能力可能发生改变，从而可能导致宿主体内的代谢改变。
图3 斑马鱼暴露于1和100 μg/L TET时肝脏中的代谢变化。（a）代谢组学分析检测到的上调和下调重要代谢物。（b）重要代谢物的热图分析。（c）100 µg / L的重要代谢途径的富集分析。
4.暴露于TET引起肝脂质代谢相关基因表达的变化
接下来，分析了与斑马鱼肝脏中脂质转运和生成高度相关的一些靶向基因的表达。具体来说，脂质转运（即apoa4，fabp2和fabp11）和脂质生成因子（即pparαb，pparγ和c /ebpα）所涉及的基因表达变化如图4所示。在TET暴露下，斑马鱼肝脏中涉及的基因全部上调，且具有明显的剂量依赖性。例如，在1和100 µg / L的TET中apoa4分别增加了3倍和5倍。
Fabp2和fabp11是斑马鱼基因组中的两个编码脂肪酸结合蛋白（FABP）的基因，它们与饱和，不饱和和长链脂肪酸结合并因此充当其载体。之前的研究发现某些FABP具有将膳食脂肪酸导入斑马鱼肠细胞核中的潜力，这可能解释了经TET处理的斑马鱼肝组织中FA的增加。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）转录因子可响应细胞中脂质水平的变化，进而调节脂质存储和代谢基因的表达。PPARα会增加促进FAs在包括肝组织在内的组织中摄取和利用的基因的表达，而PPARγ激活会增加脂肪细胞和其他组织中FA的摄取和脂肪生成。在许多肥胖症模型中，肝中PPARγ的表达，特别是PPARγ2的表达显著增加。此外，小鼠中apoa4的过度表达导致TAG的血浆浓度升高。总的来说，基因表达的改变与代谢组学和脂质组学的观察结果一致，表明肝脏中脂肪酸代谢成TAGs可能是体重增加的潜在机制。
图4 斑马鱼暴露于1和100μg/ L TET时肝脏中参与脂质代谢的基因的表达。（a）脂质转运（apoa4，fabp2和fabp11）和（b）脂肪形成因子（pparαb，pparγ和c /ebpα）基因的相对表达。
5.TET暴露下肠道菌群的紊乱
在小鼠和猪中观察到了由抗生素暴露引起的肠道菌群失调。在以前的研究中已经提出了与抗生素引起的肠道菌群失调有关的肥胖症)。因此，作者对TET暴露后斑马鱼肠道菌群的变化进行了检测。在聚类和比对后，总共得到了515,052个序列，并在所有样本中基于97%聚类分析发现了105个OTU。在105个OTU中，大多数OTU（n = 67，64％）为1和100μg/L TET处理的样品所共同发现（图S3）。
肠内容物样品的稀疏曲线表明，测序深度满足需要（图S4）。同时，结果表明，TET暴露样品的菌群丰富度高于对照样品，特别是在1μg/ L时。进一步通过α多样性指数（包括Chao指数，Sobs指数和Shannon指数）证实了这一观察结果，与对照相比，TET暴露的斑马鱼肠道微生物组的多样性显著提高（图5a）。整个数据集的OTU组成进行NMDS分析，该图显示每个组中紧密聚集（图S5）。计算所有成对样本组合的Bray-Curtis指数，PERMANOVA测试发现三组之间的系统发育结构存在显著差异（Bonferroni校正的p <0.05）。总而言之，作者观察到低剂量的抗生素TET暴露可以增加肠道菌群多样性，尽管这些药物的高剂量抑制细菌的生长。该结果与先前的一些研究一致。例如，用低剂量青霉素治疗小鼠还显示出增加的系统发育多样性。另一方面，低剂量的TET可以触发大肠杆菌的生长，这可能是群落多样性增加的原因，其中某些细菌物种的生长可能被低剂量的TET触发。
根据菌群组成的门系统分析，在三种处理中，Fusobacteria，Firmicutes和Bacteroidetes三种门水平丰度最高（图5b）。作者观察到在两个TET处理水平上部分门水平有轻微变化。但是，在3种门中发生显著变化，与1 µg / L TET暴露相比，在100 µg/L TET暴露下，Firmicutes减少了6.2倍，Bacteroidetes减少了2.4倍，而Proteobacteria增加了2.0倍。有趣的是，在1和100 µg / L的TET暴露量下，Bacteroidetes/Firmicutes的比例分别为增加到2.9和0.19。与100 µg / L相比，在1 µg/L的暴露下增加更高。据描述，Bacteroidetes/Firmicutes的比例在肥胖小鼠中高于正常体重的小鼠。此外，通常将Firmicutes的丰度增加视为致肥胖因素; 然而，作者仅观察到在1 µg / L TET暴露下，Firmicutes的相对丰度略有增加。
为了确定TET处理组和对照组之间在丰度上存在显著差异的分类细菌类群，使用线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）方法进行了生物标记分析。如图5c和d所示，在LDA阈值为3.5时有15个细菌具有显著统计学差异。具体而言，在1μg/ L TET组样品中富集了Firmicutes (门), Ersipelotrichia (纲), Erysipelotrichales (目), Erysipelotrichaceae (科), and Erysipelotrichaceae_g_norank (属) （所有p <0.05）。此外，在1μg/L TET组中，属于Ersipelotrichia为16.3％，但在对照组中仅占14.3％，在100 μg/L TET组中占2.3％（图S6）。有趣的是，高脂饮食会导致肥胖动物的Ersipelotrichia比例增加，这可被视为斑马鱼体重增加的潜在生物标志物。
图5 暴露于1和100μg/ L TET时斑马鱼肠道菌群变化。（a）微生物多样性指数；（b）门水平相对丰度（c）LEfSe分析（d）LDA评分，阈值为3.5。
6.TET暴露下斑马鱼肠道微生物组的预测功能能力的变化
考虑到肠道菌群的功能可能导致宿主生理发生改变这一事实，研究了TET诱导的斑马鱼肠道菌群功能的变化。在这里，作者采用了16s rRNA基因序列PICRUSt分析预测KEGG类别和功能酶。该预测在生成了129个KEGG functions 和207个直系同源物组（COG）簇，相对丰度均高于0.1％。膜运输，碳水化合物代谢和氨基酸代谢是高度丰富的KEGG代谢途径之一（图S7），而氨基酸运输和代谢，碳水化合物运输和代谢以及能量产生和转化是斑马鱼中高度丰富的COG功能类别之一（图6a）。有趣的是，与对照相比，TET暴露中脂质转运和代谢途径的COG丰度显著升高（图6b）。即使在此阶段尚不清楚确切的机制，但由上调途径引起的代谢物水平失调可能可能是斑马鱼宿主体内脂质蓄积的原因，从而导致体重增加。先前已经提出了许多解释肠道微生物营养不良与体重增加有关的机制。例如，已知由肠道微生物组（包括脂多糖（LPS））分泌的免疫调节化合物对免疫系统的调节与宿主肥胖有关。
图6 暴露于1和100μg/ L TET时斑马鱼肠道菌群变化预测所导致的代谢功能变化。（a）COG功能分类和（b）脂质转运和代谢的COG丰度。
结论
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