编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肠道健康依赖于CD4+调节性T细胞(Treg)的免疫抑制活性。转录因子Foxp3的表达定义了这个谱系，并且饮食或共生微生物源抗原可以在胸腺外诱导Foxp3的表达，该过程由Foxp3增强子协助（保守非编码序列1（CNS1））。包括丁酸在内的微生物发酵产物促进外周Treg（pTreg）细胞的生成，表明代谢产物决定结肠免疫细胞群的组成。
除饮食成分外，细菌还改变宿主来源的分子，产生许多生物活性物质。胆汁酸的细菌转化就是一个典型的例子，这一过程产生一个具有一系列生理功能的复杂类固醇库。该研究筛选解偶联胆汁酸的主要种类，探究这些胆汁酸增强pTreg细胞分化的能力。
研究发现，次级胆汁酸3β-羟基脱氧胆酸（isoDCA）通过作用于树突状细胞（DC）减弱其免疫刺激特性，增加Foxp3诱导作用。树突状细胞中有一种受体，即法尼斯样X受体，它的去除促进T细胞的产生，并产生一种类似于isoDCA诱导的转录谱，表明这种胆汁酸与核受体之间存在相互作用。为了在体内研究isoDCA，采用合成生物学方法，设计包含工程菌拟杆菌菌株的最小微生物菌群。产生IsoDCA的微生物菌群以CNS1依赖性方式增加表达结肠RORγt的Treg细胞数量，表明胸腺外分化增强。
论文ID
原名：Bacterial metabolism of bile acids promotes generation of peripheral regulatory T cells
译名：胆汁酸的细菌代谢促进外周调节性T细胞的产生
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2020.4.15
通信作者：Alexander Y. Rudensky
通信作者单位：美国纽约斯隆·凯特琳纪念癌症中心斯隆·凯特琳研究所
实验设计
结果
1.胆汁酸的细菌差向异构作用产生具有Treg细胞诱导活性的分子
胆汁酸是胆固醇衍生的分子，参与基本的生理过程，包括营养吸收，葡萄糖稳态和能量消耗调节。内分泌信号刺激胆囊排空进入十二指肠，胆汁酸帮助乳化饮食脂肪。哺乳动物的初级或肝脏来源的胆汁酸大多与牛磺酸或甘氨酸结合，并通过小肠中的微生物胆盐水解酶进行解偶联。虽然大多数胆汁酸通过肠肝循环运输回肝脏，但其中一小部分（约5%）逃过回肠的再吸收，在结肠中进一步细菌转化，产生次级胆汁酸
结肠pTreg细胞的产生受微生物代谢物的影响，我们筛选小鼠和人体内主要的解偶联胆汁酸，观察其在体外增强Foxp3诱导的能力（图1a-c），在非最佳的Treg细胞诱导条件下，两种次级胆汁酸ω-鼠胆酸（ω-MCA）和isoDCA可以有效地增加DC诱导的未成熟CD4+ T细胞中Foxp3+细胞的频率（图1d）。两种胆汁酸均不影响促炎TH17细胞的分化，表明胆汁酸对Treg细胞的产生有特定的影响。
因为isoDCA和ω-MCA都是同分异构体分子，没有Treg细胞促进活性，所以我们假设特定羟基（-OH）基团的空间取向是其作用的必要条件。由DCA形成isoDCA需要将3α-OH基团氧化为-氧代中间体，然后将其还原为3β-OH基团。尽管仍缺乏良好的表征，但据报道，β-MCA转化为ω-MCA也可生成抗氧中间体。我们观察到DCA的3-氧代衍生物不能像isoDCA一样增强Treg细胞的诱导作用（图1e）。类似地，6α-OH基团的氧化消除ω-MCA对Treg细胞的诱导作用，表明胆汁酸的微生物差向异构作用产生具有独特免疫调节特性的代谢产物。与ω-MCA不同，isoDCA在健康成年人的肠道中含量很高（约50μM），并且其生物合成得到很好的表征。因此，我们专注于了解isoDCA的生物学活性。
胆汁酸的两亲性使这些分子成为天然的清洁剂，对细胞活力和增殖有潜在的有害影响。鉴于与T细胞增殖减少相关的条件有利于Foxp3的表达，我们评估了这一机制是否可以解释胆汁酸介导的T细胞分化的增强。与载体相比，IsoDCA显著降低T细胞增殖（图1f）。我们观察到3-oxoDCA处理的细胞也有类似的作用，但并没有以剂量依赖的方式促进Treg细胞的生成，说明增殖的减少并不能单独解释Foxp3+ T细胞频率的增加。接下来，我们评估isoDCA介导的Treg细胞诱导增强是否需要DC。当未成熟T细胞被CD3/CD28抗体包被的磁珠激活时，isoDCA和3-oxoDCA均未增加Treg细胞的频率。相反，这两种胆汁酸都导致Foxp3+细胞百分比下降（图1g），同时也伴随着增殖减少。与这些观察结果一致，当缺乏Foxp3增强子CNS3的未成熟T细胞与DCs共培养时，isoDCA仍可增强Treg细胞频率。总之，这些结果支持抗原呈递细胞（APCs）在介导isoDCA的T细胞诱导作用方面的必要性，并提出了T细胞外源性的免疫调节机制，该机制不同于其他胆汁酸的报道。
图1.胆汁酸的细菌差向异构化产生具有Treg细胞诱导活性的分子。
a.胆汁酸的类型。b.胆汁酸的基本结构。c.筛选试验：在非最佳的T reg细胞诱导条件下，将未成熟的CD4+ T细胞与DC共培养，并在第3天通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分析，a中所列胆汁酸按d、e、g中所示剂量添加。d.不同浓度胆汁酸处理后Foxp3+ CD4+ T细胞的频率。e.isoDCA的3β-OH基团具有诱导T reg细胞的作用。如c中所述共培养细胞，并与3-oxoDCA或isoDCA以指定浓度孵育。f.评估细胞增殖。原始的CD4+ T细胞用Cell Trace Violet（CTV）标记，并像在c中一样，在isoDCA或3-oxoDCA（100μM）的存在下用DC培养。在第3天通过FACS评估CTV稀释度。g.在没有DC的情况下胆汁酸对T reg细胞分化的影响。在非最佳的Treg细胞诱导条件下，用CD3 / CD28抗体包被的磁珠激活未成熟CD4+ T细胞。以指定的浓度添加IsoDCA和3-oxoDCA，并在第3天通过FACS分析细胞。
2.isoDCA增强Treg细胞生成需要DC表达FXR
胆汁酸通过与许多受体的相互作用影响哺乳动物的生理机能，包括法尼醇X受体（FXR）。因此，我们使用来自CD4 creNr1h4 fl / fl和CD4 WTNr1h4 fl / fl小鼠的未成熟CD4 + T细胞，以及来自Csf1r cre Nr1h4 fl /fl和Csf1r WT Nr1h4 fl / fl小鼠的DC评估在isoDCA诱导Treg细胞中FXR的潜在作用。T细胞中FXR的缺失并没有改变Foxp3对isoDCA的应答（图2a，左图）。相比之下，缺乏FXR的DC在基线时产生更高频率的Foxp3 +细胞，而添加isoDCA则不能进一步提高这一频率（图2a，右图）。这些结果支持我们的发现，即isoDCA作用于DCs，增强Treg细胞的诱导，且FXR参与这一过程。为了排除脾脏DC群作为APC的潜在差异的影响，我们分析Csf1r cre Nr1h4fl/fl小鼠和野生型同窝对照中DC的组成。虽然我们未能检测到脾脏和其他器官中CD11c + MHC II+类细胞群（主要是DCs）组成的差异。我们在Csf1r cre Nr1h4 fl/fl小鼠的大肠固有层（LILP）中观察到更多的Foxp3 +细胞，尤其是RORγt + Foxp3 +子集，由于响应微生物抗原而产生的pTreg细胞主要是RORγt+，这些数据表明，髓样区室中FXR的缺乏在体内促进Treg细胞的胸腺外生成。
接下来，进行RNA测序（RNA-seq）分析，以全面评估isoDCA处理和FXR清除对DCs的影响。暴露于isoDCA的DCs显示与抗原加工和呈递相关的几种基因的表达降低，包括Ciita，Ctse，H2ab，H2eb和H2dma（图2b）。参与检测和转导促炎信号的基因如Tlr7、Tlr12、Nlrc5、Stat2、Stat6、Irf1和Irf7也被下调，干扰素信号下游的几个基因也是如此。在isoDCA处理诱导的基因中，我们鉴定了NFκB，丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和细胞因子受体信号转导的负调控子，包括Nfkbia，Dusp1，Dusp5和Socs1。鉴于isoDCA的转录谱提示了一种全面的抗炎状态，我们测试这种胆汁酸对DC产生抗原特异性T细胞和分泌细胞因子的能力的影响。当激动剂刺激Toll样受体（TLR）时，IsoDCA处理降低炎性细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）-α和白介素（IL）-6的产生。我们还使用一种报告基因T细胞系，其中绿色荧光蛋白（GFP）在NFAT（活化T细胞的核因子）的控制下，并表达OT-II MHC-II限制的卵清蛋白特异性T细胞抗原受体（TCR）。我们发现，用卵清蛋白脉冲处理后，isoDCA降低该细胞系的DC介导的活化，表明该胆汁酸具有广泛的抗炎活性。
鉴于我们的研究结果表明FXR在isoDCA诱导Treg细胞中起作用，我们比较FXR缺乏和胆汁酸暴露引起的转录变化。响应于isoDCA处理而被显著调节的基因在FXR缺陷和FXR充足细胞之间差异表达（图2c），表明两种干扰导致DC的相似转录变化。值得注意的是，与野生型细胞相比，在缺乏FXR的DC中，有超过54％的isoDCA处理诱导的基因显着上调（图2c，d），表明isoDCA可以抵消FXR介导的转录抑制。尽管与野生型细胞相比，FXR缺陷的DC中，响应isoDCA的转录本的表达水平普遍较低（图2c），但当FXR缺陷的DC经isoDCA处理后，其表达水平进一步降低（图2e,f）。因此，虽然FXR可能有助于驱动胆汁酸处理后基因表达的下调，但这些结果表明，其他独立于FXR的机制也可以调节这些靶标。接下来，我们试图描述FXR和isoDCA之间的分子相互作用。尽管天然存在的FXR激动剂鹅脱氧胆酸（CDCA）导致重组FXR配体结合域（LBD）的解链温度发生显著变化，但isoDCA产生的变化不那么明显，仅在高配体蛋白比时才明显（图2g）。根据这一观察，CDCA在FXR荧光素酶报告基因实验中产生一个强大的信号，但isoDCA处理没有效果（图2h）。这些结果提示FXR和isoDCA之间存在一种独特的相互作用模式，并增加这种核受体功能拮抗的可能性。实际上，我们观察到isoDCA响应合成的FXR激动剂GW4064降低荧光素酶报道基因信号（图2i）。为证实这些数据，我们发现在基于荧光共振能量转移（FRET）的共激活剂招募试验中，isoDCA限制CDCA诱导的FXR活性（图2j）。这些发现表明，拮抗APC的FXR依赖性转录输出可能有助于isoDCA的pTreg细胞诱导作用。
图2.isoDCA增强Treg细胞生成需要DC表达FXR。
a. T细胞或DCs中FXR缺陷对isoDCA诱导Treg细胞的影响。b-f.暴露于胆汁酸24小时后，经FACS纯化的DC的RNA-seq分析。b.用isoDCA（50μM）处理的WT DC的转录谱分析。差异表达的基因呈橙色。c.FC图比较isoDCA处理和FXR缺乏引起的转录变化。被isoDCA下调的基因显示为蓝色；isoDCA诱导的基因呈橙色。d.由isoDCA处理（橙色）和FXR缺乏（蓝色）调节的基因之间存在重叠。e.FC的图比较isoDCA对WT（x轴）和FXR缺陷（y轴）DC的影响。f.WT（橙色）和FXR缺陷（蓝色）DC中由isoDCA调节的基因之间的重叠。g.用重组FXR LBD和胆汁酸以1,000倍（500μM）或200倍（100μM）过量的差示扫描荧光法（DSF）实验。显示FXR LBD的玻尔兹曼熔化温度。h,i.萤光素酶报告基因测定。j.基于FRET的共激活剂招募试验。
3.设计产生isoDCA的拟杆菌拟杆菌（B. theta）菌株
然后，我们探索isoDCA在体内的生物学效应。由胆酸产生isoDCA至少需要两种不同细菌进行的化学转化。在梭状芽胞杆菌中观察到胆酸裂解7α-羟基的能力，而在瘤胃球菌中表征了DCA的3α-羟基的差向异构作用（图3a）。为了评估结肠中胆汁酸细菌转化的影响，将来自R.gnavus的羟基类固醇脱氢酶插入到拟杆菌中，重建isoDCA的异构化途径（图3b）。Rumgna_00694编码的酶的活性位点包含一个酪氨酸残基，该残基被同源模型预测为保守，我们用苯丙氨酸创造了一个催化死亡的突变体（图3c）。正如预期的那样，我们观察到工程B.theta菌株产生大量的isoDCA，而相应的突变菌株产生的DCA则无法检测到（图3d）。
图3.设计产生isoDCA的拟杆菌拟杆菌（B. theta）菌株。
a. 来自DCA参与isoDCA形成的酶。b. 重组B. theta中isoDCA生成途径的克隆策略。c. 一个催化死亡(eCD)突变体Rumgna_00694 (Rg00694)的设计原理。d.通过薄层色谱法（TLC）表征B. theta eWT和B. theta eCD菌株的生化活性。
4.包含产生isoDCA的菌株的菌群可促进体内pTreg细胞的产生
拟杆菌属物种缺乏7α-脱羟基活性。我们将C.scindens与我们的工程菌株结合，组成一个产生isoDCA的菌群（图4a，b）。所有定植条件均提高结肠T reg细胞的百分比，包括RORγt+细胞子集（图4c）。尽管大部分Foxp3 +细胞的频率相似，但与定殖催化死亡菌株的小鼠相比，接受功能菌群小鼠显示RORγt+ pTreg细胞亚群显着增加（图4d）。与梭状芽胞杆菌和次级胆汁酸原产于结肠的观点一致，我们未能在肠系膜淋巴结或小肠固有层中检测到不同水平的表达RORγt的pTreg细胞。尽管Foxp3RORγt+ CD4 + T细胞在粪便微生物群移植（FMT）常规小鼠结肠中被强烈诱导，但在10天和4周后，该效应T细胞群体在接受功能性菌群或催化性死亡菌群的小鼠之间具有可比性。与我们的体外发现一致，即isoDCA对TH 17细胞的生成没有实质性影响。相比之下，结肠RORγt+ pTreg细胞的频率差异在这个较晚的时间点上仍然存在，尽管它们并不那么明显。
为了排除细菌菌株背景的潜在影响并概括这些初步发现，我们设计另外两种肠道共生菌来生产isoDCA。为此，我们使用上述策略构建脆弱的拟杆菌和卵形拟杆菌的功能性和催化死亡菌株。所有功能性工程拟杆菌均在体外将DCA转化为isoDCA，与B.thetaeWT相比，B.frageWT和B.ovaeWT产生更多的isoDCA，与用液相色谱-质谱法测定的R. gnavus相似。催化死亡菌株培养上清液中未检测到isoDCA。功能改造的B. frag和B. ova菌株与其各自对应的催化死亡菌株相比，还诱导产生更高频率的结肠RORγt+ T reg细胞（图4e，f），表明这种效应并不依赖于特定的菌株背景，也不太可能是由isoDCA对细菌的潜在反馈引起的。值得注意的是，被高产菌株（B. frag eWT）定殖的动物盲肠内容物中的isoDCA水平没有超过接受FMT的小鼠，表明我们对这种酶促途径的重建并未导致至超生理学胆汁酸水平。短链脂肪酸(SCFAs)的产量在各联合菌群之间具有可比性，提示胆汁酸转化对细菌代谢没有广泛影响，并且产生isoDCA的细菌能够在其他致耐受性代谢物的存在下增加pT reg细胞的数量。
鉴于引入到拟杆菌中的羟基类固醇脱氢酶可能会修饰除DCA以外的底物，我们在没有7α-脱羟基的共生化合物（即无梭状梭菌）的情况下测试工程菌的效果。定殖功能或催化性死亡细菌的B.frag或B.ova的无菌小鼠导致结肠RORγt+ pT reg细胞的频率相似（图4g，h），表明我们生产isoDCA的菌群的生物学活性取决于产生DCA的细菌。为了确认我们的工程菌株在体内促进真正的pTreg细胞生成，我们将具有功能或催化性死亡的菌群定殖无细菌CNS1充足（Foxp3GFP）和-缺陷（Foxp3GFPΔCNS1）小鼠。通过与定殖催化死亡菌群的对照进行比较，在CNS1充足的动物中，定殖功能性菌群导致Foxp3 +RORγt+ pTreg细胞的频率更高（图4i，j）。当被功能性或催化性死亡的菌群定殖时，基因阻碍了pTreg细胞产生的CNS1缺陷宿主，显示同样的低频Foxp3 + RORγt + CD4 + T细胞（图4i，j）。这些实验表明，用产生isoDCA的微生物群定殖小鼠可促进结肠pTreg细胞从头产生。
图4.包含产生isoDCA的菌株的菌群可促进体内pTreg细胞的产生。
由最小的微生物群产生的isoDCA。b.实验设置，无菌小鼠由C.scindens和B.theta eWT或C.scindens和B.theta eCD组成的联合菌群定植。FMT和非定殖小鼠（用磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理）作为参考。在第10天通过FACS分析LILP中的免疫细胞组成。c,d.Foxp3 +（c）和RORγt + Treg细胞频率（d）。e，f.用C.scindens联合工程菌B. ova（e）或B. frag（f）定植的无菌小鼠中，RORγt+ Treg细胞的频率。g,h.无7-α-脱羟基细菌（无梭状梭菌）的无菌小鼠接种B.frag eWT或B.frag eCD ，显示的是Foxp3 +（g）和RORγt+（h）T reg细胞的频率。I,j.给无菌的Foxp3 GFP和Foxp3GFPΔCNS1同窝小鼠灌服S.scindens和B.theta eWT（i）或C.scindens和B.frag eWT（j）
总结
以前，pTreg细胞显示出在微生物定殖过程中抑制免疫反应并支持肠道菌群的代谢功能。这种对共生菌的免疫耐受以及其他类型的宿主微生物相互作用的建立，可能是围绕着微生物群落的保守特征而进化的，比如它们的代谢产量。支持这一概念，研究发现除了细菌发酵产物外，次级胆汁酸isoDCA也是pTreg细胞的有效诱导剂。使用经过工程改造的拟杆菌属菌株作为合理设计的最小微生物群的一部分，产生isoDCA的细菌以CNS1依赖性方式在体内促进pTreg细胞的产生。IsoDCA限制DC中的FXR活性，并赋予它们抗炎表型。虽然本研究数据支持髓细胞固有的FXR活性参与pTreg细胞的诱导，但该受体和其他胆汁酸受体在介导isoDCA对粘膜免疫环境的影响方面的相对贡献仍有待研究。总之，本研究发现表明，内源性类固醇的微生物代谢有助于结肠的免疫平衡。
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