编译：翟雅鑫，编辑：小菌菌、江舜尧。
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论文ID
原名：Earth microbial co-occurrence network reveals interconnection pattern across microbiomes
译名：基于共存网络分析地球上微生物群落间的互连模式
期刊：Microbiome
IF：10.465
时间：2020.6
通讯作者：徐建明
通讯作者单位：浙江大学环境与资源学院
实验设计
1.EMP的丰度表
本研究中使用的微生物丰度表为EMP数据集90 bp Deblur结果。该测序结果分析基于Qiime2多组学分析平台，Deblur去除错误结果并将序列统一切除至90bp（最短测序运行的长度）。EMP采用统一的标准工作流程进行土壤收集、元数据管理、DNA提取、测序和序列预处理，以避免不同环境扩增子组合时的误差。对丰度表中的序列进行优化，去除读数小于25 reads的序列。然后，我们从90 bp Deblur BIOM表中提取了EMP本源3级（表S1）14个环境类别的14个计数矩阵。过滤相对丰度小于0.001% ESV并在相应的环境计数矩阵中表达少于10%的样本。上述分析均使用R语言3.6.0完成。
2 网络分析
参考Lima-Mendez等人的试验方法通过选择Spearman相关性和Bray-Curtis相异性度量构建微生物分类群共生网络。简而言之，为了计算P值，我们分别通过改组各类群丰度和从替换样本中重新采样来生成置换和自举分布（每个1000次迭代）。然后将P值作为拟合自举分布的平均值和标准偏差的高斯曲线零值的概率。通过重新归一化步骤来减轻Spearman相关性计算排列的组成偏差。分别参考Brown和Benjamini-Hochberg的试验方法对特定P值进行测定和校对。最后，边根据大于0.05的P值调整，去掉得分低于用随机矩阵理论方法确定的阈值或在评估显着性后不受两种测量支持的边。为了提高计算效率，我们分别计算了EMP本源3级的14个环境类别的14个分类单元网络。网络反卷积用于检测这些网络中的间接共现（α=1，β=0.9）。然后将14个分类群网络合并为一个全球网络。
3.修剪微生物群落数据集
为了避免分类单元或样本数量偏差，我们将各种环境的每个群落数据集修剪成相同的分类单元编号和相同的样本编号。我们保留了400个丰富度最高的ESV，并在修剪后的微生物群落矩阵中随机选择了360个样本。植物和动物的微生物组小于修剪矩阵，不参与推断修剪数据集的子网络。
4.环境对共存模式的影响
通过将绝对遗漏分数（OS）（没有环境类别的Spearman相关性）除以绝对原始Spearman分数来评估环境类别对网络中每个边Spearman相关性的影响。为了说明组的大小，对随机，相同大小的样本集重复计算OS。非参数P值计算为随机OS小于样本组OS的次数除以随机OS的数量（每个分类对1000个）。当OS与绝对原始分数之比低于1且多次测试校正的P值（Benjamini-Hochberg）低于0.05时，边被定义为特殊边。
5.过表达分析
统计使用R 3.6.0中的统计软件包完成。使用stats：：phyper超几何分布评估高分类等级分类群数量的过度表达显著性。使用stats：：pbinom实现的二项式分布执行互斥与共存分析，背景概率由网络中边的频率估算。在所有测试中，根据Benjamini，Hochberg和Yekutieli（BY）调整P值以进行多次测试；使用stats：：P.adjust进行调整。
6 基于文献对预测的共存关系进行评估
我们对具有共存关系的已知物种对进行了计数，并过滤了在网络中出现少于三次的物种对。然后，我们建立了一个包含812对具有显著过表达物种共存关系的列表（P<0.05）。我们通过查询特定共存关系的两个物种名称来筛选从Web of Science检索的文献来确认共存关系是否在文献中报道。筛选文献的方案如下：
（i）筛选文献中直接观察到的关系，如竞争或共生关系；
（ii）如果没有直接关系，就在文献中筛选相同样品的共存关系；
（iii）如果没有共存关系，进一步检查这两个物种是否属于同一类群；
（iv）如果不属于，这个边就标记为未报道的关系。
结果
1.地球微生物共存网络
构建了14个代表不同环境的微生物共现网络，包含12646个精确序列变量（ESV）。为了降噪和假阳性预测，网络包含的ESV至少在10%的样本中存在；我们还使用了保守的统计截止值（见“材料和方法”一节）。这14个网络通过重叠顶点和边被合并成一个单一的地球微生物共生网络；最终的网络由2928个顶点和54299个去除未连接顶点后的边组成（图1a）。无标度特性（R2=0.19，P<0.001）和丰度与等级之间的独立性（R2=-0.08，P=0.07）表明该微生物网络中存在非随机共生模式（图S1）。通过对ESV进行注释，我们能够识别812个在全球微生物共生网络中出现了两次以上的类群对。我们通过文献挖掘（文件S1）验证了432个具有共存关系的边、15个边处于同一类群和6个具有竞争关系的边。虽然这只占全球微生物共生网络中边的1.5%，但812个分类群对占6个以上环境中边的30%。
图1 地球微生物共存网络。（a）地球微生物共存网络中8个主要模块的布局和分类概况。模块（M1–M8）以不同的颜色显示。（b）网络中14个环境的顶点分布，橙色表示对应环境的顶点。
这个全球网络表现出高度的模块化，但在53个模块中，87.9%的顶点只存在于其中的8个（图S2）。在这8个模块中，前5个模块密集地嵌套在一个巨大的模块中，而模块6、7和8与这个较大的模块保持隔离（图S3）。所有8个模块都由不同的分类单元组成，主要菌属包括Clostridia、Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria和Gammaproteobacteria组成（图1a）。土壤、非盐水、动物远侧肠管和动物表面的微生物组的顶点在8个模块中均有出现（图1b；图S4a），并且在不同模块中存在过表达现象（图S4b）。动物体微生物组的顶点大多局限于M3，过表达频率比随机表达频率高3.1%，植物体表微生物组的顶点主要在模块M3和M4中，过表达频率比随机表达频率分别高4.6%和2.3%（图S4a-b）。
2.共存网络的系统发育关系
通过观察各类群非随机边的分布进行系统发育研究，结果表明大多数共存关系来自于Alphaproteobacteria，Clostridia和Deltaproteobacteria（图2a）。大多数优势类群间组合的过表达频率高于随机表达频率（图2b），Flavobacteriia、Gemmatinonadetes、Bacteroidia、Anaeroblineae、Gemmatinonadetes和Bacteroidia等稀有类群中只有某些组合过表达频率高于随机表达频率。对于类群内共存关系，只有Deltaproteobacteria、Planctomycetia、Anaerolineae和Acidobacteria Gp2过表达频率高于随机表达频率。鉴于不同环境的子网显示不同的共存模式，某些共存关系仅在特定环境中过表达频率高于随机表达频率（图2c）。
图2 微生物优势类群共存模式。（a）优势类群共存连接概况，最主要的优势类群予以颜色标注。（b）分类单元间共存连接的过表达，点表明相对应的一对分类单元共存连接的过表达显著（P<0.05）。（c）14个环境子网络中个类群间共存连接的显著性过表达。
3.拓扑组分
为了避免样本和ESV数量引起的误差，我们对每种环境的12个子网进行推断时均采用大小一致的数据库（请参见“材料和方法”部分）。12个环境子网的拓扑组分存在很大差异（图3）。虽然数据集被修剪成相同的大小，但动物远端肠道子网络边的数量（4574）是非盐水表面子网络（350）的13倍。直径值范围为4~6，但与边数不存在相关关系。动物近端肠道（0.22）和盐渍沉积物（0.22）的子网聚类系数值高于其他环境子网。非盐水表面子网的平均分离度（0.30）和模块化度（2.7）最高。动物远端肠道（212.6）和土壤（206.0）子网的平均中介中心值大于其他环境。
图3 基于大小一致的12个环境微生物丰度数据库对子网的网络拓扑结构进行推断。微生物丰度数据库包含400个最高丰度的ESV，从中随机抽取360个样本。
4.通用边和特殊边
通用边存在于多个子网中，在相应子网中占比34.3%~57.0%（图4a）。除了非盐水，动物分泌物以及植物和动物的表面之外，通用边在大多数子网中占比不到50%。使用遗漏分数（OS，请参见“材料和方法”部分）评估通用边的环境定位。只有3.4%的通用边缘被识别为局部边缘（数据文件S2）。存在于单个子网中的特殊边可以连接存在于环境特定子网中的环境特定顶点对，或者连接存在于至少两个子网中的一般顶点对。连接特定顶点对的特殊边的比例占动物近端肠道子网络边的54.5%和根际子网络边的52.4%，但仅占动物分泌子网络边的15.6%。连接通用顶点对的特殊边的比例在相应子网络中的边数的9.6%到29.8%；除了动物近端肠道（9.6%），根际（13.3%）和盐水（19.1%）子网外占比均超过20%。通用边的比例与连接特定顶点对的特殊边的比例呈负相关（ρ=-0.87，P<0.001），但与连接接通用顶点对的特殊边的比例不存在相关关系（ρ=0.11，P<0.72）（图S5）。此外，这三种边缘类型的比例与子网中的边数量不相关（P>0.10）（图S6）。
三种边中前50个丰度最高的关联顶点存在差异（图4b）。例如，Sphingobacterium丰度最高的是与通用边相关联的点，丰度最高的边是Sphingobacterium-Spartobacteria、Sphingobacterium-Legionella和Sphingobacterium-Solirubrobacter（文件S2）。Microgenomates丰度最高的是与特殊边相关联的点，丰度最高的边是Microgenomates-Armatimonates。关联点的分类状况受环境影响（图S7-S9）。
根据子网之间的边重叠情况，将12个环境归为两组（图4c）。一组由土壤，非盐水，动物表面和动物远端肠道的子网组成（第一组）；另一组由动物，盐水和沉积物的根际，植物表面，分泌和近端肠道的子网组成。，非盐水沉积物和表面（第二组）。这两组主要通过植物和动物的表面微生物群联系在一起。
图4 基于12个环境微生物丰度数据库推断出的子网通用边和特殊边。（a）三种类型边在子网中的占比情况。（b）与三种边相关联的顶点的分类状况。（c）基于Jaccard距离矩阵的共存关系相似性得出的12个环境间的互连关系。
5.网络集点
从每个子网中识别出具有最高程度的10个网络集点。共获得120个网络集点分属于60个ESV（图5a），主要来自Clostridia、Deltaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Actinobacteria和Gammaproteobacteria（图5b）。根据上述结果，可将12个子网通过边重叠方法聚类为两组。AcidobacteriaGp2和Nisaea被确定为大多数子网的中心。Latescibacteria被确定为土壤，非盐水，动物表面和动物远端肠道（第一组）所有子网络的中心。Treponema、Micrococcus和Methanobrevibacte被确定为根际，植物表面，动物分泌和近端肠道，盐水和沉积物以及非盐水沉积物和表面（第二组）的四个子网络的中心。其中，有37个网络集点仅存于一个子网中，被确定为特殊网络集点。土壤，盐碱沉积物和根际的子网中各含有5个这样的网络集点。
图5 基于12个环境微生物丰度数据库推断出的子网内网络集点分类情况。（a）120个网络集点在各类群中的占比情况。（b）各个子网中10个网络集点包含菌属概况。12个环境的子网根据网络集点分类特征的聚类结果
6.负相关共存连接
由图6可知，呈负相关关系的边在12个子网中的占比为1.9%~48.9%。除土壤（1.9%）和非盐水（7.5%）的子网外，大多数子网呈负相关关系的边占10%以上。在动物相关微生物组（动物表面，分泌物，远端和近端肠道）的子网中，呈负相关关系的边占比为10.1%~20.1%，在植物相关微生物组（根际和植物）的子网中占比为27.1%~30.8%。沉积物子网中占比为32.8%~39.7%，非盐地表子网中占比达到48.9%。与这些边相连的顶点主要来自于Alphaproteobacteria、Actinobacteria、Clostridia、Deltaproteobacteria和Gammaproteobacteria，但是分类情况受环境影响。大部分呈负相关关系的边与土壤，盐渍沉积物和动物近端肠道子网中的Acidobacteria、盐水和非盐水子网中Spirochaetia和在植物、动物表面、非盐环境子网中Sphingobacteria连接。然而，除Spartobacteria- Acidobacteria Gp10、Legionella-Plantactinospora、Acidobacteria Gp6 -AcidobacteriaGp10之间的负相关共存关系外，属水平上呈负相关关系的边均为环境特异性的（文件S3）。
图6 基于12个环境微生物丰度数据库推断出的子网中负相关边的概况。中心的饼图子网中表示负相关边的占比和数量。周围的饼图表示边的分类情况。
讨论
这种微生物共生网络的模块性随环境的变化而变化。先前的研究表明存在如水深或土壤性质等环境因子驱动形成的模块。此外，鉴于微生物共生网络中的模块可能代表不同的生态位，模块中当前的环境模式也可能指示不同环境中微生物共存模式的相似性。例如，在当前的全球微生物共生网络中，盐水和盐渍沉积物、植物表面和根际以及动植物体等微生物组中发现了相似的模块分布。
不同环境子网络拓扑特征的差异表明不同环境具有独特的微生物共存模式。
动物远端肠道子网络中的大量边数表明在该环境中存在高密度的相互作用。在动物近端肠道和盐渍沉积物的子网络中，较高的聚类系数可能表明了交叉互补关系，包括丰富的降解途径、生态位过滤或环境异质性。非盐表面子网络中高平均分离度和模块化的表明存在复杂的生态过程或环境梯度。中间性中心度是基于最短路径的网络中顶点的中心度。换言之，中间性得分较高的顶点将充当从图的一部分到另一部分的桥梁。较高的介电中心度表明，更多的微生物在动物远侧肠道和土壤的子网络中架起模块之间的桥梁。
由于在大多数子网中，特殊边占比超过一半，其对共存模式的贡献高于通用边。该结果表明，不同的环境中存在着不同的微生物共存关系。除了连接特殊顶点的特殊边之外，每个环境都有自己的特殊边连接在其他环境中出现的类群。根据我们的结果，我们推测微生物共存关系可能是描述不同环境中微生物群落的一个重要方面。因此，微生物共存模式成为除微生物类群组成之外研究微生物组的新方向。尽管先前研究结果表明土壤、非盐水、动物表面和动物远端肠道等微生物的组分存在差异，但子网络之间边的重叠表明了这些环境中微生物共存模式具有相似性。微生物组聚类结果与子网络中与子网络中基于网络集散点聚类结果一致。植物和动物表面微生物群的所处位置可能表明这些微生物群具有桥接其他微生物群中的作用。由于环境微生物群中未培养类群的比例较高，引物、DNA提取和PCR反应的偏差，仍然无法在群落尺度上验证不同环境中所推断的边的存在。
通用边和连接通用顶点的特殊边之间的不同分类情况表明，通用类群可以在不同环境下显示不同的共存模式。我们发现丰度最高的通用边都与Sphingobacterium连接，Sphingobacterium在土壤、水、动物、植物相关微生物群中普遍存在。然而，无处不在的存在不能保证形成通用边，因为大量的特殊边连接了通用顶点对。例如，Microgenomates和Armatimonadetes在11个环境中共表达，但仅在动物远端肠道子网络中形成边。
位于枢纽位置的物种非常重要，因为它们可能与大量其他物种相关联。在大多数环境中，AcidobacteriaGp2和Nisaea的较高等级可能是由于它们的高流行率以及它们的通用生活方式。AcidobacteriaGp和Nisaea在不同环境中获得了具有各种分类学特征的边，表明这些属有可能在广泛的生态系统上同步生态过程。存在于第一组环境子网的特殊枢纽中的Latescibacteria来自未经培养的菌门。从宏基因组分析中回收的基因组片段表明它在广泛的栖息地中普遍存在，但不同Latescibacteria喜欢特定的栖息地并具有不同的生态功能。Latescibacteria可能在动物肠道和沉积物以及土壤中的多糖降解等厌氧栖息地的纤维素体生产中发挥重要作用。这些生态功能可能使Latescibacteria成为第一组环境子网的特殊枢纽。Treponema是动物远端肠道子网络的枢纽，是人类肠道微生物群的特征共生体。Micrococcus是植物表面和非盐表面子网络的枢纽，在生物膜形成中起着关键作用。Methanobrevibacter是动物远端肠道子网络的枢纽，与人类肠道中20种产氢Clostridales正相关。此外，大部分专业网络集点表明，网络集点可以代表各种环境中的共现特征。我们注意到很难正确推断网络集点，并且尚不清楚网络集点状态是否也意味着在生态系统中的关键处具有特殊作用，尽管最初的实验表明情况确实如此。
呈负相关关系的边可能来源于广泛的共同排斥机制，包括直接竞争，毒素生产，环境修改和差异生态位适应。不同比例的负边表明不同环境中的各种竞争强度或利基差异。土壤子网中负面边缘的比例较低表明土壤中普遍存在合作或利基共享，其中异质微环境可以减少直接竞争。与酸杆菌相关的土壤子网中的大部分负边缘在土壤环境中普遍存在，但在培养研究中代表性不足。通过宏基因组学方法预测的酸杆菌的生态能力暗示了土壤中具有竞争力的生活方式。沉积物和地表资料中负边缘的高比例表明，沉积物和地表环境中的竞争或次富分化更为普遍。与土壤相比，沉积物和地表环境中由于其相对均匀的微环境而存在较少的生态位。植物相关微生物组子网络中负边缘的比例高于动物相关微生物组的子网络，表明竞争或生态位分化在植物相关微生物组中更为普遍。
结论
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