编译：gu作成熟，编辑：小菌菌、江舜尧。
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了解构建植物微生物组的遗传和环境因素，对于利用这些相互作用来满足农业、保护和可持续发展的关键需求是必要的。豆科植物与固氮根瘤菌形成根瘤共生，几十年来一直作为理解植物与微生物有益相互作用的遗传学和进化的模式植物，因此作为植物与微生物组相互作用的模型具有附加价值。
在这里，我们使用带有16S rRNA基因扩增子和鸟枪宏基因组测序对常见园林实验来研究在两个原生土壤群落中生长的豆科植物Medicago truncatula三种基因型中微生物组多样性和组成的驱动因素。外部(根际)和内部(根内圈、根瘤内圈和叶内圈)的细菌多样性下降。由于根际土壤起源效应显著，根内圈植物基因型效应显著，群落组成受到室间-土壤起源和室间-植物基因型强相互作用的影响。尽管如此，所有的隔室都由Ensifer占主导地位，Ensifer是与M.truncatula形成根结节共生的根瘤菌属，此外，鸟枪式宏基因组测序表明，结节部位的Ensifer与植物其他地方的Ensifer在基因上无法区分。我们还发现了一些在结核组织中常见的OTU，这些OTU很可能是从根内圈中繁殖出来的。我们的结果证明了强大的寄主过滤效应，土壤来源驱动的根际和寄主遗传驱动的植物内部隔间，并确定了几个在原生范围内与根瘤菌共存的关键节点栖息类群。们的研究结果为将来的功能遗传实验奠定了基础，这些实验旨在扩大我们对豆科植物-根瘤菌共生关系的理解，使我们对植物微生物群落有更深入的理解。
论文ID
实验设计
为了研究宿主和共生体的遗传变异如何影响苜蓿根际、根内圈、根瘤和叶球中的微生物群落，进行了两个实验。
在“植物基因型×土壤”实验中，分别在来源于药用植物原生范围的两种土壤中种植了三种植物基因型，以探究植物的遗传变异是如何构建植物微生物组的，土壤来源对微生物组变异的作用是什么。
在“根瘤菌基因型”实验中，我们采用单一植物基因型和土壤群落，分别接种了来自两个物种的4株Ensifer (2株E. meliloti和2株E. medicae)中的一株，探讨了根瘤菌遗传变异是否可以改变植物的微生物群落。
本文选取了3个典型药用植物基因型(G1、G27、G96)。从田间生长的植物基部收集土壤。从明尼苏达大学的培养物中获得了用于根瘤菌基因型实验的Ensifer菌株。种子由法国蒙彼利埃国家农学研究所(INRA)收集，保存在法国蒙彼利埃国家农学研究所植物遗传与改良站。
对于每个土壤处理，来自法国或科西嘉岛的原生土壤以1:1的比例加入到无菌土壤培养基中(在121℃下自动加温四次，每次45分钟，干湿循环交替)。播种前，种子在稀释(5%)漂白剂中表面浸渍5分钟，无菌水冲洗，然后在潮湿的滤纸上冷分层2天，直到种子发芽。将带有本地土壤混合物的幼苗种植到无菌、密封、完全自足的品红容器 "利奥纳罐 "中，以防止交叉污染和本地土壤以外的微生物的繁殖。这里组装了3个GA7容器（Caisson Labs，Smithfield UT），底部的罐子作为水盆，中间的罐子装满土壤介质，上部的罐子作为植物生长的空间。一个消毒尼龙芯通过一个钻孔连接下盒和中盒。将品红盆随机放置在温控生长室(23℃)中，人工光照设置为12h天，每周随机重新排列两次，直至收获。
在根瘤菌基因型实验中，我们分别接种了3株同样生长的复制株(只有G96和来自法国大陆的土壤)和4株根瘤菌:2株Ensifer medicae (KH36b和A321)和2株Ensifer meliloti (M156和HM007-10)。接种后，品红盆每周重新排列两次，与植物基因型×土壤实验同时进行，生长条件相同。在根-茎交界面切下植株，每个植株随机选取6片叶片置于无菌微离心管中。叶片组织用1% Triton-X 100 (v:v)通过涡流和ddH2O清洗三次来重新移动任何表面颗粒或附生微生物，以确保只保留真正的内生微生物成员。组织在ddH2O中冲洗以去除松散粘着的土壤。根被置于装有40mL ddH2O的50- mL无菌猎鹰管中，并彻底搅拌以去除根际土壤。
接下来，将4毫升这种根际土壤浆液放入微中心管中并造粒。将这些根际土壤直接置于PowerSoil DNA分离试剂盒的提取管中。将洗过的植物根置于无菌培养皿中，收集所有结节，随机将5个活结节置于DNA提取管中。剩余的根材料切成约5 cm的切片，随机收集6个根段(总共30cm的根组织)，置于微离心管中，30%漂白剂表面灭菌60秒，ddH2O冲洗3次。将Phyllosphere(叶)、rhizosphere、nodule和endosphere(根)组织放入提取试剂盒中，并在−20℃保存直到DNA提取。
结果
1 测序结果-16s rRNA扩增子测序
经过所有的序列质量控制、OTU分界和去除稀有OTU后，我们为植物基因型×土壤实验保留了3180个OTU，为根瘤菌基因型实验保留了1650个OTU。
2 测序结果-宏基因组测序
经过质量控制，每个样品平均保留4100万对末端读数。删除映射到Medicago引用的读对后，根endo- sphere样本平均包含600万读对，而结核样本包含3400万读对。平均而言，在根内圈样品中，其余读数的25％成功映射到了参考样品，而在结节样品中，则为90％。
3 植物基因型×土壤试验
几项结果表明，分室是构建Medicago植物微生物组的主要力量。首先，PVCA表明与室间相互作用解释了细菌群落组成中最大的变异量(室×土壤源:23%，室×植物基因型:6%;表1)表明土壤来源和植物基因型对群落组成均有影响，但这些影响取决于隔室。植物基因型、土壤来源、隔室和土壤来源与植物基因型相互作用的主效应各占细菌组成变异的1.2-3.2%(约10.9%;表1)。多样性估计值(多样性、均匀度和丰富度)的方差分析表明，隔室是唯一显著的影响(表1)，根茎层的细菌群落最丰富、最多样、最均匀(图1a)。我们发现，没有证据表明植物基因型之间或土壤源之间的多样性估计值存在总体差异(表1)。为了揭示PVCA中显示的相互作用，我们接下来使用PerMANOVAs分别测试了土壤来源和植物基因型对每个隔间内细菌群落组成的影响。源自法国大陆与科西嘉岛的土壤之间的根系群落是不同的(表2)，但这种土壤来源的遗留问题在内部植物区系中消失了(表2)。相反，根内的细菌群落对植物基因型有反应(表2，图2)，尽管基因型对根瘤或叶隔室不重要(表2)。四个隔间的细菌群落非常不同(表1;图1 b)。Ensifer属包含与Medicago形成根结节共生的初级固氮根瘤菌，在所有区间中含量最丰富，尽管它在植物内部区间中达到较高的丰度，特别是在根结节中，它在那里占了约85%的读数；图1b）。LEfSe分析确认313个根际生物标记物OTUs，具有广泛的分类特征，其中一些是常见的(图3b)。其他OTU的丰度在植物内部各区间发生了明显的变化，包括卤单胞菌(与结节相比，根和叶内层的丰度增加；图3a)和假单胞菌(相对于根和结节，叶内的丰度增加；图3c)。尽管寄主基因型对根系群落有很强的影响(表2)，但我们的LEfSe分析并未发现OTUs作为特定植物基因型的生物标记物，这表明这些群落差异主要是由OTU丰度比率的改变而非特定类群的排除造成的。但有趣的是，当我们比较三种植物基因型的根系和根圈细菌群落的异同时，与G1相比，植物基因型G96的根系和根圈细菌群落更加相似(图2b)，这可能说明该宿主基因型G96对外界细菌的 "过滤 "不那么严格。
表1 摘要利用改良主方差分量分析(PVCA)对科西属土壤来源(法国)、植物基因型(G1、G27、G96)、植物隔层(根际、根、根茎、叶)及所有可能的相互作用所解释的群落变异量进行了分析。进一步，多样性估计方差分析结果提出了同一设计。Simpson多样性和均匀度的补体采用logit变换，丰富度采用Box-Cox函数变换
表2 通过区间测试对土壤产地（科西嘉或法国）和植物基因型对细菌群落组成的影响进行PerMANOVA。PerMANOVA测试基于Bray-Curtis异质性矩阵，使用每个样本1500个序列（1000次迭代）深度的迭代子抽样。伪F检验统计量、自由度和P值被提出，显著的检验以粗体和斜体显示。
图1 细菌多样性指标(a)和四个研究区间最丰富的细菌OTU(b)的丰度(平均值±SE)。所有的估计都是基于迭代子采样（每次迭代1000次，每次1500个序列）。字母代表各区间的显著差异（Tukey HSD）。
图2 根内圈中的细菌群落对植物基因型的反应 a 按基因型绘制的细菌根内生菌的NMDS（Bray-Curtis），插图显示轴2加载分数（解释了48.36%的群落变异），跨基因型（方差分析）。b配对的根内圈和根内圈样品之间的平均细菌布雷-柯蒂斯异同值（样品按植物配对。
图3 根与根茎(a)、根际与根(b)、根与叶(c)间各OTU丰度对比的20个最丰度OTU对效应量分析细菌属在左侧，OTU编号在括号中列出。呈现的是配对效应大小的五分位数(最小、25%、中位数、75%、最大值)[例如，结节-根/(结节+根)]，其中1.0的值表示该OTU仅在结节中发现，而-1.0的值表示该属仅在根中发现。采用Wilcoxon符号秩检验对各区间OTU的显著富集度进行检验，如有显著性，则用检验统计数据和P值表示。
4 根瘤菌基因型实验
与植物基因型×土壤实验形成鲜明对比的是，根瘤菌基因型实验在不同根瘤菌菌株的多样性估计上没有产生任何差异（丰富度、多样性和均匀度的菌株P>0.30），也没有产生根瘤菌菌株×隔室的相互作用。然而，各区间确实存在差异，根系圈具有较高的丰富性(P <0.001)、多样性(P = 0.002)和均匀性(P = 0.021) 。
5 Ensifer(OTU1)的最小熵分解
在Ensifer内的4个划定的最小熵分解(MED)节点中，代表了OTU内的变化，只有两个节点是共同的(节点3和节点6；分别占总节点数的84.89%和15.02%)。法国和科西嘉岛之间在植物中发现的这两个MED节的比例不同(χ 2 = 3775.6，P <0.001)。在科西嘉土壤中生长的植物具有较高的节3发生率(法国土壤中为87.5% vs.79.9%)，节6发生率降低(法国土壤中为12.4% vs.20.6%)，这些差异在四个植物区系中的每一个区系中都是一致的，表明Ensifer变体对植物基因型进行了不同的定植。然而，不同隔间的模式不同。相对于其他两个宿主基因型，植物基因型G96在结节和根中含有较小比例的MED结节3(结节-G96为78.5%，G1和G27分别为90.2%和90.3%；根-G96为60.1%，G1和G27分别为99.8%和87.1%)，但实际上根圈样品中的结节3更多(G96为99.9%，G1和G27分别为65.2%和64.9%)。然而，在叶片中，G27和G96是相似的(> 99%)而G1中节点3所占比例较小(节点3为83.3%，节点6为16.6%)。这表明Ensifer MED节点在植物内的成员资格是由土壤来源和宿主基因型驱动的，但模式一般是一致的，独立于植物区系。
6 宏基因组测序
由于Ensifer是所有区系中的优势类群，并且在16S rRNA基因上的MED分析表明Ensifer OTU内的多样性极小（见上文），我们使用元基因组猎枪测序来进一步研究不同区系中Ensifer种群的全基因组相似性。从根内生菌和结核群落中重建的Ensifer支架在同源区域中平均有99%的全球序列同一性--这表明Ensifer在整个个体植物中极为相似。此外，我们对含有两种共生巨浆体的Ensifer细胞的分数的估计在植物区室之间没有显著差异(W= 132，P= 0.10为pSMED01;W = 151，P = 0.14为pSMED02;图4)-再次表明Ensifer在整个植物中高度相似，包括在共生巨浆体。
图4 来自根与结节内层隔室的Ensifer的基因组含量，来自枪式元基因组测序数据，显示为映射到共生质粒（黑色为pSymB，白色为pSymA）的读数相对于染色体的中位数比例。每个方框的下界和上界分别表示第一和第三四分位数，胡须代表观察值的范围。
讨论
土壤来源影响微生物群
土壤微生物群落具有显著的多样性，是植物定植的源库。研究发现，土壤来源对土壤的整体影响大于植物基因型，根际群落对土壤来源的反应尤为强烈。显著的土壤来源变异表明，如果我们从更多的地点取样，将会发现更多的根球类群。这是值得注意的，因为根际群落比特化的植物群落更加多样化，而且根际动力学可以对植物的适应性产生深远的影响。微生物通过植物分泌物的产生被吸收到根际。这些渗出物可以提供养分来源，并与土壤条件相互作用，形成与周围土壤不同的环境，促进微生物生长，为无数微生物-微生物相互作用创造条件，形成这个动态群落。这些构成根际的因素，在很大程度上依赖于土壤的非生物和生物方面;因此，土壤变化对根际微生物群落的影响是不足为怪的。尽管根际群落存在这种差异，而且根际包裹着根，是内圈定植的源群落，但内在化的植物微生物群落在土壤中是一致的，与限制进入植物内部的植物遗传、细胞和/或生物化学机制一致。
植物基因型构成了药用植物微生物组
植物的遗传变异在根内圈的结构变异中起作用，而在其他区域则不起作用。虽然我们没有发现植物基因型构造了根际群落，但在其他系统的研究已经确认了这种效应。对药用植物基因型的检测可以很好地揭示出渗出液的遗传变异，这可能导致根际和/或根瘤和叶间隔的变异。重要的是，在封闭的，底部浇水的盒子里种植植物可能导致我们低估了叶子内层的潜水能力和错过关键类群; 我们的叶子细菌很可能是通过植物血管的垂直迁移来定植的，而自然界中的叶子通常是由外部来源定植的。在我们的实验中，植物生长在原生土壤中;因此，我们很可能捕获了一组生态相关和共同进化的微生物，它们在自然界中殖民Medicago。特别是，我们所取样的根内圈类群很可能包含许多原生麦地那植物内的 "核心 "角色，至少在这里取样的分类学规模（属或以上，见下文 "讨论"），因为我们的结果加入了许多其他研究，表明植物是其环境微生物的强大过滤器，土壤来源对内部隔间的影响很小。实上，在我们的研究中，微生物群落的多样性从植物的外部到内部——从根际到根/叶的内圈再到根瘤内圈——都减少了。因此，尽管在生态位宽度理论的更广泛背景下考虑这种变异，可以帮助我们理解植物-微生物共生关系，但随着植物数量遗传学和微生物组研究的结合，我们在研究控制微生物组多样性和控制微生物组共生位置的植物基因方面的能力也在增强。微生物群落组成的变异可以在植物基因型之间分割，从而归于植物遗传变异，代表了自然界中选择可以作用的自然变异，也代表了对优化植物微生物相互作用感兴趣的植物育种者可以利用的常态遗传变异量。在我们的实验中，由基因型解释的变异数量可能低估了多种因素。先,我们只调查了三个植物基因型;因此，我们不能解释在这三种基因型中没有表现出来的任何遗传变异。当然，这种变异也存在于至少一些研究较少的植物微生物组的类群中。事实上，一项最新的研究表明，在紧密相关的OTUs中，在精细的分类学尺度上发生多次连续传代后，植物的基因型依赖发生了转变。我们几乎没有能力利用16次群落组成调查来整合这些更小范围的基因型效应，尽管散弹枪元基因组方法在群落转变的同时也在快速发展。
结核部位微生物组
正如预期的那样，结核微生物组由Ensifer主导，也由一个多样化的群落居住，尽管比周围的根内圈和根系圈的多样性要少（图1）。尽管有证据表明，根瘤群落是确定地从根内圈取样的，但我们没有发现证据表明该根瘤拥有独特的微生物专家，因为除了Ensifer之外，没有OTUs被发现作为该根瘤的生物标记。我们还确定了Ensifer和Halomonas之间的阳性共联关系。卤单胞菌是一种中度嗜卤菌，已被证明在盐碱地中与Ensifer共同接种时，可以提高紫花苜蓿的产量（Medicago sativa）。这提示结节内对盐胞菌敏感的间质有很强的可能。根瘤似乎代表了与相邻根内圈不同的环境，但在根瘤内和其他隔室中发现了许多OTUs。沿着这些方向，有许多非经典的根瘤菌物种(如假单胞菌、农业细菌等)从根瘤中培养出来，它们具有结瘤基因、固结基因或两者都有，这表明这些微生物可能在根瘤中起着特定的作用。尽管如此，培养工作已经确定了非根瘤菌种类，其作用是增加结瘤。额外的不确定的，协同的这种类型的微生物可能存在，但我们的研究结果表明，他们将不会严格限制在结核，可以从根或根圈群落培养。
Ensifer--Medicago微生物组中的主要角色
除了结核之外，我们的结果表明Ensifer在整个Medicago微生物组中发挥着极其重要的作用，无论是在植物的内部还是外部。在植物微生物组中，包括根和叶组织，以及豆科植物以外的多种植物中，广泛地发现了根瘤菌科的物种。事实上，我们在研究中发现了Rhizobium和Bradyrhizobium，这些类群是多个区系中微生物群落的主要成员，然而它们并没有点化Medicago。最近的系统发育重建和突变体筛选表明，这种不太特异的植物关联早于本组根结节共生的起源。因此，结球根瘤菌可能是从植物微生物群落的共生祖先进化而来的。这些过去的观察提出了一个问题，即在序列相似性以及基因组含量方面，结核中的Ensifer OTU是否与其他植物区系中的Ensifer OTU不同。这再一次凸显了检测本地土壤结合的潜在新颖性。我们的土壤是从Medicago植物的基部采集的，因此Ensifer种群很可能通过植物-土壤反馈在起始土壤群落中得到丰富。在我们的实验中，我们并没有发现根瘤菌基因型结构微生物组变异跨内圈区间或在根圈中的证据，尽管这个问题值得进一步研究。有大量证据表明，在根瘤菌基因型之间，伴侣质量(即植物从与特定根瘤菌相互作用中获得的适应效益)的遗传变异。考虑到植物微生物群落(在根瘤菌之外)中根瘤菌的丰度，它们可能在微生物与微生物的相互作用中发挥关键作用，从而影响植物的适合度，这是理所当然的。事实上，有瘤的植物已经被证明能引起微生物组组成的明显变化。在这里，我们用根瘤菌个体接种植物，这是农业和恢复的一种常见做法。在未来的实验中，人们可以研究根瘤菌遗传变异的作用，通过接种已知的高或低伙伴质量的菌株，或为具有高度特定菌株偏好的植物操纵菌株身份。
结论
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